L A B O R A T O R I U M 9 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
Walidacja metod
analitycznych  cz. III
STRESZCZENIE Dobrze zwalidowana okÅ‚adność definiowana jest jako E(x) jest definiowana jako E(x) = µx + " x .
syst
metoda analityczna jest kartą przetargową stopień zgodności między wyni- Dostajemy zatem wyrażenie [1]:
def
wielu laboratoriów komercyjnych stosujących Dkiem uzyskanym na drodze analiz
xmet E(x) x xsyst
[1].
metody nieznormalizowane lub metody metodą walidowaną a wartością, która jest
znormalizowane, ale zmodyfi kowane. akceptowana jako prawdziwa (rzeczywista). Wartość bezwzględna błędu systema-
Niekiedy czas przeprowadzanego procesu W miÄ™dzynarodowej normie ISO 5725 tycznego ½ð"x ½ð jest wiÄ™c miarÄ… niedo-
syst
walidacji odgrywa bardzo ważną rolę do opisu tego parametru stosuje się dwa kładności metody analitycznej. Wynika
w pozyskiwaniu klientów. Stąd bardzo terminy: poprawność i precyzję (1). Po- stąd, że metoda dokładna jest obarczo-
ważne jest dobranie odpowiednich prawność związana jest ze zgodnością na pewnym błędem systematycznym
parametrów walidacji, koniecznych pomiÄ™dzy Å›redniÄ… arytmetycznÄ… z dużej (" x @ð ð0ð), jego wartość jest bliska zeru,
syst
i wystarczających do stwierdzenia, czy liczby pojedynczych wyników badania natomiast metoda niedokładna charakte-
dana metoda jest właściwa do określonego a wartością prawdziwą lub też przyjętą war- ryzuje się dodatnim lub ujemnym błędem
zastosowania analitycznego. ArtykuÅ‚ jest toÅ›ciÄ… odniesienia (2). Precyzja natomiast systematycznym (" x Ä…ð ð0ð) (1).
syst
ostatnią częścią zamykającą omówienie jest miarą zgodności pomiędzy wynikami
poszczególnych parametrów wyznaczanych badania (2). W normie PN-ISO 5725- POPRAWNOŚĆ
w trakcie walidacji metod analitycznych. -1:2002 (1) zostało wyraz
nie podkreślone, A PRECYZJA METODY
SA
OWA KLUCZOWE walidacja że termin  dokładność wcześniej był Poprawność nie zawsze idzie w parze z pre-
metod analitycznych, metoda utożsamiany z poprawnością. Jest jednak cyzją metody; ilustracją tego zjawiska jest
analityczna, dokładność, precyzja, oczywiste, że dokładność musi być związana rys. 1 (str. 40) (3). Przedstawione zostały
niepewność, stabilność z brakiem rozbieżności między wynikami na nim wyniki pomiarów dla czterech me-
badania a przyjętą wartością odniesienia, tod analitycznych różniących się ze wzglę-
SUMMARY Analytical method, which a więc z wysoką precyzją metody. du na te dwa parametry. Metoda I jest
has been well validated, is usually a trump O poprawności metody można mówić poprawna i precyzyjna, ponieważ rozrzut
card for many commercial laboratories, wtedy, gdy jest sens mówić o prawdziwej uzyskanych wyników jest mały, a ich wartość
that use non-normalized or normalized wartości mierzonej wielkości. Mimo że średnia leży w pobliżu wartości prawdziwej.
but modifi ed methods. Sometimes podczas stosowania niektórych metod Metoda II jest obrazem analizy wykonanej
the time spent for validation process, analitycznych nie jest znana wartość z dużą precyzją, ale niepoprawnie, zaś me-
plays a very important role in gaining prawdziwa, możliwe jest przyjęcie warto- toda III wykonana jest poprawnie, ale jest
the client. That s why it is extremely ści odniesienia dla mierzonej wielkości. nieprecyzyjna. Metoda IV jest niepoprawna
important to choose proper validation Dzieje się tak, gdy dostępne są materiały oraz nieprecyzyjna, gdyż wartość średnia po-
parameters, which are necessary and odniesienia (materiały, których wartość miarów jest znacznie przesunięta względem
suffi cient enough to decide whether mierzonej wielkości jest dokładnie znana) wartości oczekiwanej (prawdziwej) i obser-
the method is suitable for specifi c lub też gdy przyjętą wartość odniesienia wuje się duży rozrzut wyników.
analytical usage. This paper is the fi nal można uzyskać, stosując inną metodę,
part describing validation parameters. a także wykorzystując specjalnie przy- GRANICE WYKRYWALNOŚCI
KEY WORDS validation of analytical gotowaną próbkę o znanych właściwo- I OZNACZALNOŚCI
methods, analytical method, accuracy, ściach (1). Miarą poprawności jest obcią- Pod pojęciem granicy wykrywalności metody
precision, uncertainty, stability żenie, czyli różnica pomiędzy wartością analitycznej (Limit of Detection  LOD)
oczekiwaną badania a przyjętą wartością rozumie się najmniejszą ilość lub najmniej-
odniesienia. sze stężenie substancji (pierwiastka, jonu,
Dokładność metody analitycznej de- związku) możliwe do wykrycia, ale nieko-
finiowana jest jako różnica "x między niecznie oznaczenia w danych warunkach
met
wartością oczekiwaną E(x) zbioru wyników eksperymentalnych (3) za pomocą odpo-
uzyskanych daną metodą a prawdziwą za- wiedniej techniki analitycznej z określonym
wartoÅ›ciÄ… danego analitu µx. Wartość tej prawdopodobieÅ„stwem. Inaczej mówiÄ…c,
różnicy jest równa wartości błędu systema- jest to minimalna ilość badanego analitu,
tycznego, ponieważ wartość oczekiwana obecności której jesteśmy pewni w próbce
mgr inż. Marta Piechowska zbioru wyników uzyskanych daną metodą poddawanej badaniu. Według przewodników
38
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 9 / 2 0 0 9
|
EURACHEM (4) granica wykrywalności Najczęściej jako poziom granicy oznaczal-
LOD LOQ
to punkt, w którym mierzona wartość jest ności przyjmuje się trzykrotną wartość
3.28 · sb xb + 3.28 · sb
większa od niepewności z nią związanej. granicy wykrywalności. W literaturze po-
xb + 3 · sb xb + 10 · sb
Parametr ten jest powiązany ścisłą zależ- dawane są różne formuły na wyznaczanie
3.29 · sb 10·sb
nością z określoną procedurą analityczną, granic wykrywalności LOD i oznaczalności
k · sb xb + k · sb
ponieważ jego wartość zależy od zawar- LOQ. Dlatego też wyniki uzyskiwane przez
xb + 3 · sb xb + 6 · sb
tości oznaczanego składnika oraz obec- różne laboratoria, mimo tych samych pró-
Tabela 1. Zestawienie najczęściej używanych wzorów
ności innych składników występujących bek lub identycznej techniki, zawsze będą
podczas wyznaczania granicy wykrywalności LOD oraz
oznaczalności LOQ (3).
w analizowanej próbce (5). Wynika stąd, wykazywać pewne różnice, w zależności
Xb  wartość średnia z przynajmniej 10 pomiarów ślepej próby;
że poziom szumów generowanych przez od przyjętego wzoru. W tabeli 1 znajduje
Sb  odchylenie standardowe z pomiarów dla ślepej próby
urządzenie pomiarowe wpływa w istotny się zestawienie najczęściej pojawiających się
sposób na granicę wykrywalności badanej formuł przydatnych do obliczania omawia- w takich roztworach zmian oraz kontrolo-
substancji. LOD dotyczy analiz śladowych, nych parametrów (3). wać ten proces tak, aby mógł zareagować
dlatego nie zachodzi potrzeba wyznaczania w odpowiednim czasie.
go w przypadku walidacji metod jakościo- STABILNOŚĆ METODY Stąd też bardzo przydatnym parametrem
wych ani też ilościowych, jeżeli metoda nie Próbki pobrane i przechowywane do anali- jest stabilność; poprzez jej wyznaczenie
obejmuje analizy śladów, według przewod- zy ulegają w różnym stopniu przemianom możliwe jest zbadanie stopnia niezmienno-
ników ICH Guidelines (6). fizykochemicznym oraz biochemicznym. ści bądz
też zmienności sygnału analitycz-
Granica oznaczalności (Limit of Quan- Zawartość poszczególnych związków i pier- nego w określonym czasie. Kontrola stabil-
tification  LOQ) jest to najmniejsza ilość wiastków w badanych próbkach zmienia ności próbek pozwala uniknąć poważnych
lub też najmniejsze stężenie substancji, które się w czasie. Aby zachować niezmienność błędów w trakcie dalszych etapów analiz.
można oznaczyć daną metodą analityczną, badanych próbek, stosuje się odpowiednie Dodatkowo odpowiednia analiza otrzy-
zapewniającą uzyskanie wyników pomiarów procedury ich pobierania oraz przechowy- manych w trakcie wyznaczania stabilno-
z odpowiednią precyzją i dokładnością wania (8). Przemianom podlegają również ści wyników może dostarczyć analitykowi
(4, 7). Parametr ten wyznacza się w przypad- roztwory przygotowane do analiz próbek wielu ważnych informacji na temat stopnia
ku walidacji metody ilościowej. Jego wartość oraz roztwory standardów i odczynników zmienności zachodzących w próbce pro-
jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej używanych w procesie analitycznym. Ana- cesów w jednostce czasu, a więc pozwala
wartości granicy wykrywalności LOD. lityk musi być świadomy zachodzących zaobserwować pewne trendy zmienności
reklama
INNOWACYJNE
rozwiÄ…zania oraz aplikacje
Bezpośredni kontakt, wsparcie techniczne oraz serwis zawsze na miejscu
Technologie bezpieczne i przyjazne dla środowiska
Najwyższa jakość produktów:
 Cyfrowa elektrochemia: HQD, ECOLINE
 Spektrofotometry: DR2800, DR3800, DR5000
 Sondy: NH4D, LDO, SONATAX sc
 Kolorymetry POCKET: wraz z testami kuwetowymi
HACH LANGE Sp. z o.o., 52-013 Wrocław, ul. Opolska 143a, tel. [phone], fax [phone], [e-mail]
www.hach-lange.pl
39
L A B O R A T O R I U M 9 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
zawartości poszczególnych składników
Metoda I x
w roztworach.
Warunkiem stabilności metody anali-
xxxxxxxxxx
tycznej jest trwałość roztworów, odczyn-
µx stężenie skÅ‚adnika C
ników, standardów i badanych próbek
przynajmniej przez 48 h (8). Parametr ten
jest określany jako odchylenie wyników ba-
dań jednego z roztworów analizowanego
z zachowaniem warunków powtarzalności
Metoda II x
(to samo laboratorium, ten sam analityk,
xxxxxxxx
ta sama metoda, ten sam sprzęt), np. co
µx
stężenie składnika C
godzinÄ™ przez kolejne 48 h. Najlepszym
sposobem sprawdzenia stabilności jest
porównanie wyników pomiarów po 24 h
lub 48 h z wynikami uzyskanymi tuż po
ich sporządzeniu. Jeśli różnica wynosi
Metoda III x
d"2% (w przypadku analiz jakościowych)
x xxxx x xx xx x xxx
xxx
lub d"5% (w przypadku analiz śladowych),
µx
to roztwór taki uznawany jest za stabilny
stężenie składnika C
przez 24 h lub 48 h (8).
Należy również zwrócić szczególną uwa-
gę na fakt, iż stabilność procesu analityczne-
go nie gwarantuje uzyskiwania dokładnych
Metoda IV
x
wyników. Proces może być stabilny i dawać
ponad 90% wyników niedokładnych lub
x xxxx x x x xx x x
x x x
µx
niespełniających odpowiednich wymagań.
stężenie składnika C
Stabilność nie jest więc parametrem wy-
znaczanym w procesie walidacji  zamiast ,
Rys. 1. Precyzja i poprawność czterech metod analitycznych (3)
ale powinna być wyznaczany dodatkowo,
ze szczególnym zwróceniem uwagi na pre-
cyzję pomiarów.  metody typu B, gdzie ocena wyników gdzie:
odbywa się za pomocą pomiarów prze- u (y)  niepewność złożona,
c
NIEPEWNOŚĆ prowadzonych już wcześniej, wiedzy u1, u2,..., u  niepewności standardowe
n
WYNIKU KOC
COWEGO i doświadczenia dotyczącego zacho- wynikające z poszczególnych z
ródeł
Międzynarodowy Słownik Podstawowych i Ogól- wania stosowanego przyrządu pomia- niepewności,
nych Terminów Metrologii definiuje niepew- rowego, danych dostarczonych przez  obliczenie niepewności rozszerzo-
ność jako parametr związany z wynikiem producenta aparatury bądz
odczynni- nej U określającej przedział, w którym
pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, ków, danych uzyskanych z literatury, z prawdopodobieństwem 0,95 znajduje
które można w uzasadniony sposób przy- modelu zjawisk oraz danych uzyskanych się wartość wielkości mierzonej. Otrzy-
pisać wielkości mierzonej (9). Niepewność podczas wzorcowania. muje się ją przez pomnożenie złożonej
można wyrazić jako odchylenie standardo- Proces szacowania niepewności niepewności standardowej przez współ-
we albo współczynnik zmienności, które przebiega według następującego sche- czynnik rozszerzenia k, który dla tej
zostały wyznaczone przy zachowaniu wa- matu (12): wartości prawdopodobieństwa przyj-
runków powtarzalności/odtwarzalności  specyfikacja wielkości mierzonej  usta- muje w przybliżeniu wartość 2 (do-
w trakcie walidacji metody analitycznej (10). lenie zależności matematycznej mię- kładnie 1,96).
Niepewność może być również wyrażona dzy wartością mierzoną (wyjściową) y
jako połowa szerokości przedziału ufności a wielkościami wejściowymi xi, RAPORT Z WALIDACJI
odpowiadającego określonemu poziomowi  identyfikacja z
ródeł niepewności, Przebieg charakteryzacji metody ba-
istotności (10).  wyrażenie ilościowe składników nie- dawczej oraz wyniki powinny być udo-
Na niepewność wyniku wpływa bardzo pewności, czyli wyznaczenie standar- kumentowane i przechowywane w taki
dużo czynników związanych z samym za- dowych niepewności u dla poszcze- sposób, aby w każdej chwili mogły być
planowaniem metody, badaniami i wreszcie gólnych z
ródeł niepewności, dostępne dla użytkownika. Dokumenty
samym wynikiem. Istnieje podział na różne  weryfikacja składników o dużych war- te w trakcie procesu akredytacji stano-
metody szacowania niepewności (11): tościach niepewności, wią jeden z dowodów na to, iż laborato-
 metody typu A, w której niepewność  obliczenie niepewności u (y) złożonej rium opanowało daną metodę badawczą
c
szacuje się, korzystając z wyników sta- zgodnie z zasadami dodawania nie- i kwalifikuje się do akredytacji. Raport
tystycznych serii badań tego samego pewności według wzoru [2]; końcowy z przeprowadzonego procesu
obiektu i wyraża się jako odchylenie walidacji metody powinien zawierać na-
2 2 2
uc (y) u1 u2 ... un
[2]
standardowe, stępujące dane (13):
40
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 9 / 2 0 0 9
|
 przedmiot i cel metody badań (zakres  kryteria, które należy spełnić w pro- 6. ICH Guidelines: Validation of Analytical
Methods: Definitions and Terminology. Lon-
jej stosowalności, jej rodzaj), cesie rewalidacji,
dyn 1995.
 podstawy metrologiczne,  imiÄ™ i nazwisko osoby przeprowadza-
7. RozporzÄ…dzenie Ministra Åšrodowiska z dnia
 rodzaj analitu (-ów) i skład matrycy, jącej proces walidacji,
11 lutego 2004 r. w sprawie klasyfikacji dla
 spis wszystkich wykorzystywanych od-  podsumowanie i wnioski,
prezentowania stanu wód powierzchniowych
czynników, wzorców, materiałów odnie-  spis wykorzystywanej literatury,
i podziemnych, sposobu prowadzenia moni-
sienia wraz z ich dokładną specyfikacją  potwierdzenie i podpis osoby odpo-
toringu oraz sposobu interpretacji wyników
(czystość, jakość, producent, w przypad- wiedzialnej za sprawdzenie i zatwier-
i prezentacji stanu tych wód (Dz.U. nr 32,
ku syntezy w laboratorium  dokÅ‚adny dzenie procesu walidacji. qð
poz. 284).
opis tej syntezy),
8. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne
 opis procedur służących do sprawdza-
Piśmiennictwo w analizie chemicznej. Wydawnictwo Nau-
nia czystości stosowanych substancji
1. PN-ISO 5725-1 (2002): Dokładność (po- kowe PWN, 2002.
i jakości wykorzystywanych wzorców, prawność i precyzja) metod pomiarowych 9. ISO Guide 99: International Vocabulary
i wyników pomiarów. Część 1: Ogólne zasady of Basic and General Terms in Metrology. Ge-
 środki ostrożności,
i definicje. neva. 1993.
 szczegółowy opis warunków przepro-
2. PN-ISO 3534-1 (2002): Statystyka. Terminolo- 10. EURACHEM/CITAC. Quantifying Uncer-
wadzenia procedury analitycznej,
gia i symbole  Część 1: Ogólne terminy z zakresu tainty in Analytical Measurement. 2nd Edi-
 opis postępowania statystycznego
rachunku prawdopodobieństwa i statystyki. tion. 2000.
wraz z załączonymi odpowiednimi
3. Szczepańska J., Kmiecik E.: Statystyczna 11. Materiały z VII Sympozjum Klubu Polskich
równaniami i obliczeniami,
kontrola jakości danych w monitoringu wód Laboratoriów Badawczych: Walidacja me-
 opis procedury w celu kontroli jakości
podziemnych. Wydawnictwa AGH, Kraków tod badawczych. Referaty. Pollab, Zakopane
w przypadku analiz rutynowych,
1998. 2001.
 odpowiednie rysunki i wykresy, np.
4. EURACHEM: The Fitness for Purpose of Ana- 12. POLLAB. 2002: Przewodnik EURA-
chromatografy, krzywe kalibracyjne,
lytical Methods. A laboratory Guide to Method CHEM/CITAC. Wyrażanie niepewności
 zgodność wyznaczonych parametrów
Validation and Related Topics. Eurachem, pomiaru analitycznego. Biuletyn POLLAB.
metody z założonymi wartościami
December 1998. 2/37/2002. Warszawa.
granicznymi, 5. Konieczka P.: Walidacja metodyk analitycz- 13. PN-EN ISO/IEC 17025 (2001): Ogólne
 wartość niepewności pomiaru anali- nych. Politechnika Gdańska. Wydział Che- wymagania dotyczące kompetencji laborato-
miczny. Katedra Chemii Analitycznej. riów badawczych i wzorcujących.
tycznego,
reklama
Laboratoryjne systemy uzdatniania wody
z
ródło wody w Twoim laboratorium
www. hl pol ska. pl
Hydrolab Polska tel.: [phone]
80-126 Gdańsk, tel.: [phone]
ul. Myśliwska 10 [e-mail]
ISO 9001:2001 Projektowanie, produkcja, serwis laboratoryjnych systemów uzdatniania wody
41