L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
Walidacja
metod analitycznych
 cz. II
STRESZCZENIE Dobrze alidacja każdej metody polega metod, którymi oznaczany jest tylko jeden
zwalidowana metoda analityczna jest na przeprowadzeniu odpowied- wskaz
nik, specyficzność wyznaczana jest
kartą przetargową wielu laboratoriów Wnich testów, których wyniki po- rzadko i ustępuje miejsca selektywności.
komercyjnych stosujących metody służą do stwierdzenia, czy dana metoda Selektywność z definicji (2) jest zdol-
nieznormalizowane lub metody analityczna jest przydatna do określonego nością metody do jednoznacznego okre-
znormalizowane, ale zmodyfi kowane. zastosowania. Dobór parametrów ściśle ślenia analitu w obecności składników,
Niekiedy czas przeprowadzanego procesu zależy od metody; ważne jest, jakie sub- które mogą być obecne w badanej próbce
walidacji odgrywa bardzo ważną rolę stancje są oznaczane za jej pomocą oraz  mogą to być zanieczyszczenia produk-
w pozyskiwaniu klientów. Stąd bardzo ile ich jest, jakich rzędów wielkości na- cyjne, produkty degradacji lub substancje
istotne jest dobranie odpowiednich leży się spodziewać i co jest materiałem pomocnicze (1). Ocena tego parametru
parametrów walidacji, koniecznych badanym. Każdy analityk, podejmując jest istotna, ponieważ konieczne jest usta-
i wystarczających do stwierdzenia, czy decyzję o przeprowadzanych w trakcie lenie, czy sygnał otrzymywany w wyniku
dana metoda jest właściwa do określonego walidacji testów, powinien wziąć pod pomiaru pochodzi właśnie od badanego
zastosowania analitycznego. Dwa uwagę przydatność danego parametru. analitu, czy też jego wielkość związana
kolejne artykuły poświęcone zostaną Podstawowe parametry walidacji to: jest z ilością oznaczanego wskaz
nika oraz
omówieniu tych parametrów.  specyficzność/selektywność metody, dodatkowo z obecnością innych substan-
SA
OWA KLUCZOWE walidacja czyli jej możliwości do jakościowego cji (fizycznie lub chemicznie podobnych
metod analitycznych, metoda lub ilościowego wykrycia pewnych spe- do analitu) w badanej próbce i modyfiku-
analityczna, liniowość, precyzja cyficznych cech badanego obiektu; jących sygnał analityczny. Wszystkie sub-
 liniowość metody; stancje, które zmieniają (podwyższają bądz

SUMMARY Analytical method, which  zakres zastosowania metody lub przy- obniżają) sygnał pochodzący od oznacza-
has been well validated, is usually a trump rzÄ…du; nej substancji, nazywane sÄ… interferenta-
card for many commercial laboratories  precyzja, czyli powtarzalność i od- mi. Selektywność metody wyznacza się
using non-normalized or normalized but twarzalność; poprzez oznaczenie zawartości danego
modified methods. Sometimes the time  dokładność; analitu z dodatkiem substancji przeszka-
in which the validation process takes place  granica wykrywalności oraz granica dzających (jeśli możliwa jest ich identy-
plays a very important role in gaining new oznaczalności; fikacja) w różnych porcjach w badanym
customers. For this reason it is extremely  stabilność, czyli niezmienność mie- materiale. Poprzez takie badanie możliwe
important to choose proper validation rzonych sygnałów w czasie; jest wyznaczenie zdolności interferentów
parameters, which are necessary and  niepewność wyniku końcowego. do modyfikacji sygnału analitycznego
sufficient to decide whether a particular w zależności od zawartości analitu oraz
method is suitable for specific analytical SPECYFICZNOŚĆ interferentów w badanej próbce.
usage. In the two subsequent papers I SELEKTYWNOŚĆ METODY
validation parameters will be described. Jedną z podstawowych właściwości każdej LINIOWOŚĆ
KEY WORDS validation metody analitycznej jest jej specyficzność I ZAKRES METODY
of analytical methods, analytical bÄ…dz
też selektywność. Specyficzność Liniowość jest parametrem szczególnie
method, linearity, precision dotyczy takiej metody, która daje sygnał ważnym, wyznaczanym w przypadku me-
tylko dla jednego analitu, natomiast se- tod ilościowych. Pod pojęciem liniowo-
lektywność odnosi się do metody dającej ści metody analitycznej należy rozumieć
sygnał dla kilku związków chemicznych, zdolność do uzyskiwania wyników badań,
których rozróżnienie jest możliwe lub też które są bezpośrednio lub też poprzez
nie. Jeśli odpowiedz
systemu analityczne- odpowiednie przekształcenia matema-
go na daną substancję można odróżnić tyczne proporcjonalne do stężeń analitów
od wszystkich innych sygnałów, metodę w próbce w danym zakresie (3). Schemat
uznaje się za selektywną (1). Od czasu, postępowania przy wyznaczaniu liniowości
mgr inż. Marta Piechowska kiedy w laboratoriach nie stosuje się już przedstawiony został na rys. 1 (str. 19).
16
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9
|
W pierwszej kolejności należy określić w badanej próbce jest proporcjonalne
Materiały referencyjne
tzw. zakres roboczy, czyli przedział stę- do sygnału analitycznego uzyskanego
do oznaczania toksyn
żeń danego analitu, w którym powinny podczas pomiaru. Potwierdzeniem tego
w żywności
się mieścić wszystkie wykonane pomiary. wniosku może być podanie współczynni-
Substancje dodatkowe, dodawane do żywności,
Liniowość bada się poprzez kolejne roz- ka korelacji r, który jest wyznacznikiem
m.in. barwniki i konserwanty, mogÄ… prowa-
cieńczenia substancji wzorcowej w taki liniowości (im jego wartość jest bliższa dzić do wzrostu ilości substancji toksycznych
w ludzkim organizmie i mieć negatywny wpływ
sposób, aby kolejne rozcieńczenia po- jedności, tym lepsza jest proporcjonal-
na zdrowie człowieka.
kryły 50-150% spodziewanego zakresu ność uzyskanych wyników ze stężeniami
W ofercie naszej firmy znajdą Państwo szeroką
roboczego. Analityk wyznaczający linio- założonymi). Jeżeli wartość tego współ-
ofertę wzorców i certyfikowanych materiałów od-
wość ma kilka możliwości postępowa- czynnika wynosi 0,995 lub więcej (mak- niesienia do analizy zawartości tych szkodliwych
substancji w żywności.
nia. Najlepiej jest, gdy przeprowadzona symalnie 1), można mówić o całkowitej
zostanie analiza co najmniej sześciu korelacji pomiędzy stężeniem analitu
Wysokiej czystości toksyny
roztworów (kolejnych rozcieńczeń) sub- a sygnałem otrzymanym podczas pomia-
naturalne
stancji wzorcowej pokrywających zale- ru w całym badanym zakresie stężeń. Gdy
cany powyżej przedział z dodatkowym współczynnik r jest mniejszy od 0,97,
Mitotoksyny
pomiarem stężenia badanego analitu trudno jest mówić o zadowalającej pro-
¨ð toksyna T-2, HT-2
¨ð womitoksyna
w ślepej próbce (1). Według (3) sytuacją porcjonalności pomiędzy stężeniem
¨ð ochratoksyny
¨ð patulina
idealną byłoby, gdyby każdy z roztwo- a otrzymanym sygnałem analitycznym
¨ð aflatoksyny
rów byÅ‚ przygotowywany indywidualnie. (4). JeÅ›li natomiast wartość ta bÄ™dzie siÄ™ ¨ð fumonizyny
¨ð zearalenon
Oczywiście dopuszczalne jest stosowanie mieściła w zakresie 0,97-0,99, to praw-
¨ð mieszaniny mikotoksyn
kolejnych rozcieńczeń, należy jednak ten dopodobnie metoda wykazuje linio-
fakt uwzględnić przy analizie błędów wość, ale w węższym zakresie. Należy
Toksyny roślinne
(niepewność wynikająca z kolejnych wtedy dokonać analiz, które pomogą
rozcieńczeń). Każdy roztwór powinien doprecyzować przedziały, w których
¨ð alkaloidy pirydynowe ¨ð solanina ¨ð kumaryna
być analizowany z trzykrotnym powtó- zachodzi warunek proporcjonalności
Toksyny morskie
rzeniem, a jako ostateczny wynik dla pomiędzy stężeniem analitu a sygnałem
danego roztworu należy przyjąć wartość pochodzącym od aparatu. Bardzo często
¨ð toksyny wywoÅ‚ujÄ…ce:
średnią z powtórzeń. W tym przypad- stosowane są dodatkowe przekształcenia  amnezję
 biegunkÄ™
ku możliwe jest również uproszczenie matematyczne sprawdzające liniowość
¨ð cytotoksyny
¨ð toksyny paralityczne
postępowania  wykonanie pojedyncze- metody w badanym zakresie.
go pomiaru dla każdego roztworu (1).
Na takim postępowaniu ciąży jednak nie- ZAKRES METODY
bezpieczeństwo popełnienia poważnego Zakres metody analitycznej jest parame-
Barwniki żywności
błędu oraz konieczność uwzględnienia trem wyznaczanym razem z liniowością
go jako z
ródła niepewności. metody i przyjmuje takie same jednost-
¨ð karotenoidy
Po otrzymaniu wyników pomiarów ki co liniowość (%, ppm, mg/l) (5). Jest ¨ð tartrazyna
¨ð chlorofil
dla poszczególnych roztworów wyznacza- to przedział (z pominięciem wartości
¨ð amarant
¨ð kurkumina
na jest zależność otrzymanego sygnału skrajnych), w obrębie którego metoda
¨ð witamina B2
¨ð kwas karminowy
analitycznego względem stężenia analitu analityczna daje wyniki o akceptowanej
w badanym roztworze w postaci prostej precyzji, dokładności i liniowości. Pisząc
prowadzącej przez otrzymane punkty. o zakresie metody analitycznej, należy
Związki zapachowe żywności
Gdy na wykresie widoczne są pojedyncze zwrócić uwagę na jeszcze jeden ważny
punkty odstajÄ…ce od ukÅ‚adu liniowego, fakt: zakres oznaczania danego analitu ¨ðtiazole
¨ð pirazyny
może to wskazywać na błąd przypadko- w badanym materiale przy użyciu tej sa-
¨ð fenole
¨ð kofeina
wy popełniony w trakcie eksperymentu. mej metody może być różny w zależności
¨ð skatole
W takiej sytuacji badanie liniowoÅ›ci nale- od matrycy badanej próbki (3). Należy ¨ð karwon, metional
ży wykonać ponownie, z zastosowaniem o tym pamiętać i nie odnosić raz wyzna-
reguł wymagających większej dokładno- czonego zakresu metody do wszystkich
Substancje toksyczne powstajÄ…ce
ści i precyzji podczas przygotowywania badanych próbek.
w procesie przetwarzania żywności
roztworów oraz pomiarów  najlepszym
¨ð 3- MCPD ¨ð akryloamid ¨ð furan ¨ð stigmastadieny
rozwiązaniem byłoby przygotowanie PRECYZJA METODY
indywidualnych roztworów o różnych ANALITYCZNEJ
W celu zapoznania się z pełną ofertą zadzwoń:
stężeniach oraz trzykrotne powtórze- Precyzja opisuje zmienność wyników po-
tel. [phone]
nie każdego pomiaru. Gdy na sporzą- wtarzanych badań. Potrzeba stosowania
Posiadamy certyfikat ISO 9001:2000
dzonym wykresie punkty układają się takiego parametru wynika stąd, że badania
w sposób liniowy (nie obserwuje się wykonywane w warunkach powtarzalno-
TUSNOVICS INSTRUMENTS POLSKA SP. Z O.O.
odchyleń od linii prostej), oznacza to, ści: na (teoretycznie) takim samym ma-
fax [phone]
iż w badanym zakresie metoda jest li- teriale, w takich samych warunkach oto-
www.tusnovics.cc.pl
niowa, a więc stężenie danego analitu czenia, tym samym przyrządem itp., nie
17
reklama
L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9 . . . W LABORATORI UM
|
ILOŚĆ ANALITU °ö%Ä…ö UDZIAA
ANALITU W PRÓBCE ZAWARTOŚĆ ANALITU W PRÓBCE DOPUSZCZALNE RSD °ö%Ä…ö
100 1 100% 1,34
10 10-1 10% 1,89
110-2 1% 2,68
0,1 10-3 0,1% 3,79
0,001 10-4 100 ppm 5,36
0,0001 10-5 10 ppm 7,58
0,00001 10-6 1 ppm 10,72
0,000001 10-7 100 ppb 15,16
0,0000001 10-8 10 ppb 21,44
0,00000001 10-9 1 ppb 30,32
Tabela 1. Wartości dopuszczalnych RSD (wyznaczone na podstawie równania Horwitza) dla precyzji w zależności od stężenia badanego analitu (1)
dają takich samych wyników. Przyczyną Precyzja  zgodnie z definicją  określa Powtarzalność, czyli minimalną
tego są niemożliwe do uniknięcia błędy rozrzut wyników pomiarów, zatem jest (najlepszą) oczekiwaną precyzję, uzy-
przypadkowe, występujące podczas każde- ona opisywana za pomocą miar rozrzu- skuje się w przypadku prowadzenia
go etapu analizy chemicznej. Zmienność tu. Procedury wyznaczania tych parame- analizy w warunkach powtarzalności.
wyników może być powodowana przez trów są bardzo podobne. Po wykonaniu Ich spełnienie gwarantuje uzyskanie
szereg czynników związanych ze stoso- niezbędnej serii pomiarów obliczana jest wyników obciążonych minimalnym
_
waniem danej procedury pomiarowej. średnia arytmetyczna x z otrzymanych błędem przypadkowym. Parametr ten
Czynniki podlegające zmianom to (6): wyników według wzoru [1], a następnie oceniany jest często na podstawie
osoba operatora, stosowana aparatura, jej odchylenie standardowe SD [2] oraz wyników uzyskanych dla minimum
kalibracja przyrządów, otoczenie (tem- względne odchylenie standardowe wyra- sześciu pomiarów z próbek przygoto-
peratura, wilgotność, zanieczyszczenia żane w procentach RSD[3]. RSD bardzo wanych na poziomie 100% zawartości
powietrza), a także odstępy czasu mię- często obliczane jest również na podsta- lub z minimum 9 pomiarów próbek
dzy pomiarami. wie zmodyfikowanego równania Hor- przygotowanych na trzech poziomach
Podczas opisywania zmienności wyni- witza (tzw. współczynnik zmienności) stężeń pokrywających wyspecyfikowany
ków otrzymanych daną metodą pomia- [4] (1). Najwygodniejszym parametrem zakres  po trzy pomiary dla każdego
rową wygodne okazało się stosowanie jest tu współczynnik zmienności, ponie- poziomu (8). W pierwszym przypadku
różnych pojęć opisujących precyzję. waż jest to wielkość względna, łatwo jest wartość wyznaczanej powtarzalności do-
W normie PN-ISO 5725-1:2002 (6) roz- więc porównywać precyzję na różnych tyczy specyficznej procedury analitycz-
różnia się dwie skrajne miary precyzji: poziomach zawartości analitu, czyli ozna- nej, w której określony i zdefiniowany
powtarzalność oraz odtwarzalność czanej substancji. jest skład matrycy (matryca to pozostałe
wyników. Dodatkowo wprowadzone składniki, które znajdują się w badanej
x1 x2 ... xn n
1
zostało do użytku pojęcie precyzji po- x próbce i w obecności których następuje
[1]
x
i
n n
i 1
średniej (7), za pomocą którego opisuje oznaczenie badanego analitu). W drugim
n
1
się zmienność wyników w warunkach
s SD
(x x)2 [2] przypadku procedura oznaczania danego
i
pośrednich pomiędzy warunkami po- n 1 analitu nie jest znana, stąd konieczność
i 1
wtarzalności i odtwarzalności. wyznaczania powtarzalności pomia-
s
[3]
RSD 100%
Warunki powtarzalności (6) uzysku- rów dla próbek różniących się składem
x
jemy, gdy badania prowadzone sÄ…: matrycy (9). Przewodnik Eurachemu
[4]
RSD 0,67 2(1 0,5 log c)
 w jednym laboratorium, (3) podaje z kolei, że do oceny powta-
 przez jednego pracownika, Gdzie: rzalności konieczne jest przeprowadzenie
_
 za pomocą tego samego wyposażenia, x  średnia arytmetyczna z n pomia- dziesięciu niezależnych pomiarów bada-
które w trakcie pomiarów nie było rów, nego materiału. Wartość obliczonego
ponownie kalibrowane, n  kolejne pomiary, względnego odchylenia standardowego
 w ciągu stosunkowo krótkiego prze- s  odchylenie standardowe (używa się od wartości średniej RSD informuje
działu czasowego, podczas którego również oznaczenia SD  standard osobę wykonującą badanie o rozrzucie
warunki prowadzenia analizy nie ule- deviation), poszczególnych wyników wokół warto-
gły zmianom. RSD  względne odchylenie standardowe ści średniej. Im jest to wartość mniejsza,
Warunki odtwarzalności (6) są do- (relative standard deviation), tym mniejszy jest rozrzut wyników wo-
kładną odwrotnością warunków powta- c  udział masowy badanego analitu kół wartości prawdziwej, a więc większa
rzalności i uzyskuje się je, gdy analiza w próbce. powtarzalność wyników. Zakres dopusz-
prowadzona jest: Mimo identycznych obliczeń wyniki czalnych odchyleń od wartości średniej
 w różnych laboratoriach i/lub powtarzalności, odtwarzalności oraz pre- zmienia się w zależności od rodzaju
 przez różnych pracowników i/lub cyzji pośredniej będą się od siebie różniły przeprowadzanej analizy, a dokładniej
 za pomocą różnej aparatury i/lub ze względu na różne warunki prowadze- od poziomu stężenia, na jakim dany
 w ciągu dłuższego przedziału czaso- nia pomiarów (warunki powtarzalności składnik jest oznaczany (analiza śladowa
wego. lub odtwarzalności). czy oznaczenie makroskładników w ba-
18
. . . W LABORATORI UM L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9
|
Wyznaczenie zakresu roboczego
Sporządzenie roztworów wzorcowych
Indywidualny Rozcieńczenia
Pomiar
3 powtórzenia Bez powtórzeń
Wykres zależności sygnału pomiarowego
w funkcji stężeń badanych roztworów
Wniosek
Metoda wykazuje liniowość Brak proporcjonalności pomiędzy
w badanym zakresie sygnałem pomiarowym a stężeniem analitu
Rys. 1. Schemat postępowania przy wyznaczaniu liniowości metody
danej próbce). Obrazem tego są dane  różne warunki prowadzenia analizy 4. Kamiński M.: Metody analizy technicznej.
przedstawione w tabeli 1, w której za- (np. inny skład fazy ruchomej w aparatu- Cz. I. Systemy zapewnienia jakości. Poli-
warte zostały wartości dopuszczalnych rze do chromatografii cieczowej, różne technika Gdańska, Wydział Chemiczny,
względnych odchyleń standardowych prędkości przepływu fazy ruchomej); Katedra Chemii Analitycznej.
dla precyzji w zależności od stężenia  różny wiek aparatury w poszczegól- 5. Czermiński J.B.: Metody statystyczne dla chemi-
badanego analitu. nych laboratoriach; ków. Wydawnictwo Naukowe PWN, 1992.
Odtwarzalność, czyli maksymalną  odczynniki, rozpuszczalniki i inne 6. PN-ISO 5725-1 (2002) Dokładność (po-
(najgorszą) oczekiwaną precyzję, uzy- materiały o różnej jakości używane prawność i precyzja) metod pomiarowych
skuje się w przypadku prowadzenia w laboratoriach. i wyników pomiarów. Część 1: Ogólne zasady
analizy w warunkach odtwarzalności. Precyzja pośrednia jest miarą zmien- i definicje.
Często o odtwarzalności mówi się ności procesu pomiarowego w dłuższym 7. PN-ISO 5725-3 (2002) Dokładność (popraw-
również jako o precyzji międzylabora- okresie; określa się ją dla metody reali- ność i precyzja) metod pomiarowych i wyników
toryjnej (10, 11), gdyż warunki odtwa- zowanej w tym samym laboratorium, pomiarów. Część 3: Pośrednie miary precyzji
rzalności są warunkami, jakie towarzy- taką samą metodą, na identycznych standardowej metody pomiarowej.
szą badaniom międzylaboratoryjnym. próbkach, ale w dłuższych odstępach 8. Pasek W.: I Konferencja, Chemometria i me-
Na podstawie wyników otrzymanych czasu pomiędzy kolejnymi pomiarami. tody zastosowania. Walidacja metod analitycz-
w podanych powyżej warunkach można Precyzja pośrednia może również doty- nych w przemyśle farmaceutycznym. Komisja
stwierdzić, czy badana metoda będzie czyć metody realizowanej przez różnych Chemometrii i Komputeryzacji Analizy
dawała zgodne wyniki w różnych labora- operatorów, na różnych przyrządach lub Chemicznej, Komitet Chemii Analitycz-
toriach. Obliczona wartość RSD będzie też kombinacji tych czynników (8). Pa- nej PAN, Zakład Chemii Analitycznej,
na ogół 2-3 razy wyższa od parametrów rametr ten wyznacza się na podstawie Wydział Chemii UJ, Zakopane 2001.
powtarzalności ze względu na szeroki minimum sześciu niezależnych oznaczeń 9. Konieczka P.: Walidacja metodyk analitycz-
zakres zmian warunków prowadzenia badanego analitu w warunkach precyzji nych. Politechnika Gdańska, Wydział Che-
badania. Należy jednak zaznaczyć, poÅ›redniej. qð miczny, Katedra Chemii Analitycznej.
że ich zmienność powinna się mieścić 10. Validation of analytical procedures. Inter-
w przedziale warunków brzegowych, Piśmiennictwo national Conference on Harmonization
w których dana metoda analityczna 1. HuberL.: Method Validation. Przewodnik ze stro- (ICH) of Technical Requirements for the
daje wiarygodne wyniki. ny internetowej www.labcompiliance.com. Registration of Pharmaceuticals for Hu-
Typowe czynniki wpływające na od- 2. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne man Use. ICH-Q2A, Geneva 1995.
twarzalność to (1): w analizie chemicznej. Wydawnictwo Nau- 11. Validation of analytical procedures: Methodology.
 różnice temperatur oraz wilgotności kowe PWN, 2002. International Conference on Harmoniza-
panujÄ…cych w laboratorium; 3. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. tion (ICH) of Technical Requirements for
 operatorzy aparatury analitycznej A laboratory Guide to Method Validation and the Registration of Pharmaceuticals for
o różnym doświadczeniu i wprawie; Related Topics. Eurachem. December 1998. Human Use. ICH-Q2B. Geneva 1996.
19