...w laboratorium
dr Rajmund Michalski
Instytut Podstaw Inżynierii Środowiska PAN, Zabrze
tel. [phone] wew. 218, e-mail: [e-mail]
Walidacja
metod analitycznych
Część I. Podstawy teoretyczne
Streszczenie Summary
W niniejszym artykule przedstawiono podstawy procesu walidacji The principles of validation process of analytical methods are
metod analitycznych. Podano zakres poszczególnych etapów described. The range of individual stages of validation procedure
procedury walidacyjnej oraz wybrane terminy i definicje, takie and selected terms and definitions such as: limit of determina-
jak: granica wykrywalności, granica oznaczalności, precyzja, tion, limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy,
dokładność, powtarzalność. repeatability are given.
SÅ‚owa kluczowe Key words
walidacja, procedura analityczna, kontrola jakości validation, analytical procedure, quality control
Wprowadzenie Metoda analityczna  konkretny sposób oznaczania określonego
W minionych latach zagadnienia związane z walidacją metod anali- analitu w określonej matrycy, za pomocą danej techniki, z wykorzy-
tycznych stały się ważną częścią praktyki laboratoryjnej. Dla wielu staniem określonego postępowania (np. metoda potencjometryczna,
jest to z
ródło stresu i nieporozumień, a tak naprawdę walidacja to nic metoda spektrofotometryczna).
innego, jak sprawdzenie metodyki, czyli czynności, które  od zawsze Procedura (metodyka) analityczna  szczegółowy sposób
były wykonywane w laboratoriach kontrolno-pomiarowych i naukowo- postępowania, uwzględniający m.in. używane stężenia i objętości
-badawczych. Nie chodzi więc o nowe biurokratyczne wymysły, lecz odczynników, szczegółowe warunki pobierania próbek analitycz-
sprawdzenie, czy charakterystyka działania metodyki jest zrozumiała, nych, sporządzanie wykresu analitycznego itp. (dotyczy większo-
i wykazanie, że jest ona poprawna pod względem naukowym w okre- ści norm).
ślonych warunkach stosowania. W praktyce laboratoryjnej najczęściej mamy do czynienia z meto-
Pełna definicja walidacji zawarta w normie PN-ISO/IEC dykami (procedurami) analitycznymi wykorzystującymi różne metody
17025:2001 (1) brzmi:  Walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i techniki analityczne.
i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczegól- Inne ważne definicje to:
ne wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania . Całkowita standardowa niepewność  standardowa niepewność
Literatura, w której opisano zagadnienia związane z walidacją meto- wyniku pomiaru, której wartość jest obliczona na podstawie niepew-
dyk analitycznych, jest obszerna zarówno w zakresie norm (2-5), jak ności parametrów wpływających na wartość analizy z zastosowaniem
i publikacji (6-10). Tematyka ta przekracza znacznie ramy niniejszego prawa propagacji niepewności.
opracowania, w którym podano jedynie główne jej założenia. Do Dokładność  zgodność pomiędzy uzyskanym wynikiem pomiaru
walidacji należy podchodzić zgodnie ze zdrowym rozsądkiem i dobrą (pojedynczego) a wartością rzeczywistą (oczekiwaną).
praktyką laboratoryjną. Istnieją rozbieżności co do zakresu tego pro- Granica wykrywalności  najmniejsza ilość (lub stężenie) wykry-
cesu nawet wśród tak znaczących organizacji, jak ICH (International wanego składnika (analitu) w badanej próbce, przy którym można go
Conference on Harmonisation) czy USP (United States Pharmacopeia). wykryć z określonym prawdopodobieństwem.
Najważniejsze z nich przedstawiono w tabeli 1 (s. 18). Granica oznaczalności  najmniejsza ilość (lub stężenie) wykry-
wanego składnika (analitu) w badanej próbce, przy którym można go
Podstawowe terminy i definicje oznaczyć daną metodą z określonym prawdopodobieństwem.
Znane są opracowania opisujące walidację w sposób wielce złożony, Odtwarzalność  precyzja wyników uzyskanych w różnych labora-
poprawne z formalnego punktu widzenia, lecz powodujÄ…ce ogromne toriach z zastosowaniem danej metody pomiarowej.
zakłopotanie u praktyka, któremu przychodzi zmierzyć się z kilku- Prawdziwość  zgodność wyniku oznaczania (jako średniej obliczo-
dziesięcioma stronami trudnego tekstu i jeszcze bardziej złożonych nej na podstawie serii pomiarów) z wartością oczekiwaną.
wzorów matematycznych. Precyzja  zgodność między niezależnymi wynikami uzyskanymi
Warto w tym miejscu przypomnieć kilka podstawowych definicji, w trakcie analizy danej próbki z zastosowaniem danej procedury
z którymi spotykamy się podczas walidacji metodyki analitycznej. Na analitycznej.
początek najważniejsze różnice pomiędzy techniką, metodą i procedurą Precyzja pośrednia  długoterminowe odchylenie procesu po-
(metodyką) analityczną. miarowego, do którego wyznaczenia wykorzystuje się odchylenie
Technika analityczna  to zespół metod analitycznych wyko- pomiarowe serii pomiarów uzyskanych w danym laboratorium w kil-
rzystujących to samo zjawisko fizyczne (np. atomowa spektrometria kutygodniowym okresie. Precyzja pośrednia jest pojęciem szerszym
absorpcyjna). niż powtarzalność.
Laboratorium | 8-9/2006
16
...w laboratorium
Powtarzalność  precyzja wyników uzyskanych w tych samych
warunkach pomiarowych (dane laboratorium, analityk, instrument
pomiarowy, odczynniki).
Rozszerzona niepewność  wielkość określająca przedział wokół uzyska-
nego wyniku analizy, w którym można na odpowiednim poziomie istotności
(prawdopodobieństwa) oczekiwać wystąpienia wartości oczekiwanej.
Standardowa niepewność pomiaru  niepewność pomiaru przed-
stawiona i obliczona jako odchylenie standardowe.
Wartość oznaczana  wartość uzyskana w wyniku zastosowania
danej procedury analitycznej. Wynik pomiaru to najczęściej średnia
arytmetyczna z uzyskanych wartości oznaczanych.
Wartość rzeczywista  wartość zgodna ze zdefiniowaną, jest na-
zywana często wartością oczekiwaną. Jest to wartość, która może być
uzyskana w wyniku doskonałego pomiaru.
Współczynnik rozszerzenia k  wartość liczbowa użyta do wymno-
żenia całkowitej standardowej niepewności pomiaru w celu uzyskania
rozszerzonej niepewności. Wartość współczynnika zależy od przyjętego
poziomu prawdopodobieństwa (np. dla 95% wynosi 2), a najczęściej
jest przyjmowana z zakresu 2-3.
Należy mieć świadomość niezwykle ważnej roli analityka w procesie uzy-
skiwania  towaru , jakim jest wynik analizy. Na jego podstawie podejmowane
są często ważne decyzje w odniesieniu do ludzi, zakładów czy środowiska.
Wynik ten zatem musi być wiarygodny, a jego rzetelność powinna być
potwierdzona w procesie walidacji stosowanych metodyk analitycznych.
Jak napisano powyżej, wynik uzyskany przez analityka jest  towarem
kupowanym przez zleceniodawcę. Istnieją wzajemne relacje pomiędzy
tymi osobami, które zestawiono w tabeli 2 (s. 18).
Zakres i etapy walidacji
procedury analitycznej
Zazwyczaj zleceniodawca nie narzuca laboratorium konkretnej
metodyki analizy, aczkolwiek powinna ona być z nim uzgodniona.
O ile istnieje taka możliwość, kryteria wyboru techniki i metodyki
analitycznej są następujące:
1. Stan skupienia próbki (analiza bezpośrednia lub pośrednia).
2. Zakres stężeń analitów.
3. Obecność czynników przeszkadzających.
4. Wymagana precyzja i dokładność oznaczania.
5. Koszty analiz (inwestycyjne, eksploatacyjne, osobowe).
6. Ochrona środowiska.
7. Osobiste upodobania i predyspozycje.
Przed przystąpieniem do procesu walidacji należy określić nastę-
pujÄ…ce parametry:
1. Rodzaj oznaczanego analitu (składnika).
2. Poziom stężeń.
3. Zakres stężeń.
4. Rodzaj matrycy.
5. Obecność substancji przeszkadzających wraz z kryteriami i koniecz-
nością ich oznaczania.
6. Istnienie odgórnych regulacji kryteriami wymogów, którym powinna
sprostać metodyka analityczna.
7. Rodzaj oczekiwanej informacji (jakościowa i/lub ilościowa).
8. Wymagana granica wykrywalności i oznaczalności.
9. Oczekiwana i wymagana precyzja i dokładność metodyki.
10. Wymagana wrażliwość (odporność) metody.
11. Wymagana aparatura  czy oznaczenia z wykorzystaniem danej
metodyki mają być przeprowadzone z wykorzystaniem ściśle
określonego przyrządu kontrolno-pomiarowego czy też przyrządów
podobnego typu.
Laboratorium | 8-9/2006
17
17
...w laboratorium
Parametr ICH USP Etapy procesu analitycznego Realizacja Przykład działania
Precyzja (powtarzalność) + + Ogólne określenie problemu Z Zanieczyszczenie wód cyjankami
Precyzja (precyzja pośrednia) +  Określenie analitycznych aspektów problemu ZA Ustalenie strategii pobierania próbek
Precyzja (odtwarzalność) +  Wybór metody/procedury analitycznej AZ Metoda chromatografii jonowej
Dokładność + + Pobieranie próbek Z+A Otrzymywanie próbek reprezentatywnych
Granica wykrywalności + + Przygotowanie próbki A Sączenie, destylacja
Granica oznaczalności + +
Pomiar natężenia prądu
Pomiar A
(detekcja amperometryczna)
Specyficzność/selektywność + +
Liniowość + + Ocena wyniku A Sporządzenie wykresu analitycznego
Zakres pomiarowy + +
Korelacja uzyskanego sygnału
ze stężeniem analitu w próbce
Odporność, wrażliwość  +
Wnioskowanie A
(obliczenia liniowości, precyzji,
Elastyczność  +
dokładności, niepewność pomiaru itp.)
Tabela 1. Zestawienie parametrów metodyki anali-
Końcowe sprawozdanie AZ Zalecenia dalszych działań
tycznej podlegajÄ…ce procesowi walidacji, zalecane
Tabela 2. Zakresy współpracy zleceniodawcy (Z) i analityka (A) w trakcie realizacji procesu analitycznego.
przez ICH i USP.
12. Możliwość zastosowania zwalidowanej metodyki w innym niż dane 1. Zmieniły się parametry metody (stwierdzone np. w wyniku we-
laboratorium. wnętrznej kontroli jakości badań).
Proces walidacji metodyki analitycznej może być prowadzony 2. Zmieniły się matryce, w których oznacza się dany składnik.
w różnej kolejności. Istnieją jednak pewne przesłanki, aby nie była to 3. Zmieniono materiały pomocnicze.
kolejność przypadkowa, i zazwyczaj pierwszym etapem jest optymali- 4. Zmieniła się zasada metody.
zacja metodyki i ocena jej selektywności. 5. Zastosowano przyrząd pomiarowy nowej generacji.
Generalnie proces walidacji może być przeprowadzony według Po prawidłowo przeprowadzonej walidacji powinno się prowadzić
poniższego schematu: i przechowywać zapisy obejmujące:
1. Określenie selektywności w wyniku analizy próbek roztworów 1. Opis sposobu przygotowania próbek materiałów wzorcowych lub
wzorcowych i rzeczywistych (m.in. optymalizacja warunków odniesienia.
oznaczania analitów, określenie wpływu substancji przeszkadza- 2. Użyte naważki i objętości roztworów.
jących, wpływu pH i matrycy próbki, optymalizacja warunków 3. Rodzaje stosowanych matryc.
rozdzielania w metodach chromatograficznych). 4. Kryteria doboru warunków analitycznych.
2. Wyznaczenie liniowości, granic wykrywalności i oznaczalności oraz 5. Warunki środowiskowe w miejscu badania.
zakresu pomiarowego. 6. ProcedurÄ™ (metodykÄ™) analitycznÄ….
3. Określenie powtarzalności (krótkookresowej precyzji). 7. Dane z
ródłowe (nieprzetworzone).
4. Wyznaczenie precyzji pośredniej. 8. Dane dotyczące zastosowanych przyrządów pomiarowych i mate-
5. Wyznaczenie dokładności na podstawie analizy próbek materiałów riałów pomocniczych.
odniesienia na różnych poziomach stężeń. 9. Odniesienie do piśmiennictwa.
6. Określenie odporności metodyki, np. na podstawie wyników po- 10. Datę(y) badania charakterystyki metody.
równań międzylaboratoryjnych. 11. Datę, imię i nazwisko wykonawcy oraz podpis.
Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania różnora- 12. Datę, imię, nazwisko i podpis zatwierdzającego dane walidacyjne
kich narzędzi, takich jak: wraz z oświadczeniem, że dana metoda jest odpowiednia do za-
1. Ślepe próbki. mierzonego zastosowania.
2. Roztwory wzorcowe. Powyżej scharakteryzowano najważniejsze aspekty walidacji metodyk
3. Próbki ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogacanie próbek). analitycznych. W kolejnej części przedstawiony zostanie praktyczny
4. Materiały odniesienia (np. certyfikowane). przykład walidacji metodyki oznaczania jonów: F-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-,
5. Statystyka. PO43- i SO42- w wodach metodÄ… chromatografii jonowej.
6. Powtórzenia.
Piśmiennictwo
Należy podkreślić, że walidacje metodyk analitycznych przeprowa-
1. PN-EN ISO/IEC 17025:2005: Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów
dza się nie tylko dla metodyk własnych (np. opracowanych w labo-
badawczych i wzorcujÄ…cych.
ratorium), lecz także dla metodyk znormalizowanych. Powody, dla 2. PN-ISO 8466-1:2004: Jakość wody. Kalibracja i ocena metod analitycznych oraz szacowanie
ich charakterystyk. Część 1: Statystyczna ocena liniowej funkcji kalibracji.
których walidację należy przeprowadzić (w ograniczonym zakresie)
3. PN-ISO 8466-2:2004: Jakość wody. Kalibracja i ocena metod analitycznych oraz
również dla metod znormalizowanych, są następujące:
szacowanie ich charakterystyk. Część 2: Metoda kalibracji dla nieliniowych funkcji
1. Różne warunki środowiskowe podczas stosowania metodyki w da- kalibracji drugiego stopnia.
4. ISO 13530:1997: Water Quality  Guide to Analytical Quality Control for Water
nym laboratorium.
Analysis.
2. Zróżnicowane kwalifikacje personelu.
5. Hulanicki A.: Współczesna chemia analityczna. PWN, Warszawa 2001.
3. Zastosowanie wyposażenia pomiarowego o odmiennej charakte- 6. Namieśnik J. (red.): Ocena i kontrola jakości wyników analitycznych. CEEAM, Poli-
technika Gdańska 2004.
rystyce.
7. Dobecki M.: Zapewnienie jakości analiz chemicznych. Wyd. Instytut Medycyny Pracy,
4. Wykonanie oznaczeń w różnych matrycach.
A
ódz
2004.
5. Występowanie czynników zakłócających w środowisku laboratorium 8. Konieczka P.: Sposoby wyznaczania granicy wykrywalności i oznaczalności.  Chemia
i Inżynieria Ekologiczna , 2003, 10/7, 639-654.
lub w badanych matrycach.
9. International Organization for Standardization: Guide to the Expression of Uncertainty
Ponadto ponownej, częściowej lub całkowitej walidacji metody
in Measurement (ISO, Geneva 1993).
badawczej laboratorium powinno dokonać, gdy: 10. Bievre P., Günzler H.: Validation in Chemical Measurement. Springer 2005.
Laboratorium | 8-9/2006
18