Biofizyka
Wykład 3 i 4
Promieniowanie elektromagnetyczne.
Widma oscylacyjne  spektroskopia w podczerwieni i
ramanowska. Spektroskopia NMR
Przykłady wykorzystania spektroskopii w podczerwieni i
ramanowskiej oraz NMR w medycynie, farmacji i innych dziedzinach
nauki.
Spektroskopia zajmuje się oddziaływaniem między promieniowaniem
elektromagnetycznym a materią, czyli zbiorem cząsteczek. Zrozumienie
oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią wymaga
zrozumienia dualnej natury promieniowania. W niektórych doświadczeniach światło
zachowuje się jak fala, w innych jak strumień fotonów o pewnej energii.
Promieniowanie elektromagnetyczne to drganie pola elektrycznego E, któremu
towarzyszy drganie pola magnetycznego B (falowa natura promieniowania
elektromagnetycznego).
http://www.physchem.co.za/OB12-
ele/radiation.htm#particle
Rys. Fala elektromagnetyczna
Każdy z wektorów pola elektrycznego i magnetycznego można opisać wzorem:
Ey(t) = E0 sin (2Ą�  kx)
Bz(t) = B0 sin (2Ą�  kx), gdzie:
�0 i B0  amplitudy, �  częstotliwość, k  wektor falowy opisany zależnością k =
(2Ą/) = �/c i biegnący wzdłuż kierunku rozchodzenia się fali
elektromagnetycznej, � = 2Ą� = 2Ąc/  częstość kątowa [radian/s]
2
Długość fali  jest odcinkiem drogi promieniowania, na którym mieści się jeden
okres drgania pola, czyli jedno drganie.
Częstotliwość (częstość) � jest to liczba drgań przypadająca na sekundę [s-1 = 1
Hz]. C=�� (C  prędkość światła, C = 2,9979 � 108 m/s
Liczba falowa � to ilość drgań przypadająca na 1 centymetr drogi przebytej przez
promieniowanie [cm-1].
Cechy jakościowe promieniowania:
- długość fali,
- częstość drgania na sekundę,
- częstość drgania na cm.
Cechy ilościowe promieniowania:
- intensywność promieniowania, I, to energia przechodząca w ciągu 1 sekundy
przez 1 cm2 powierzchni prostopadłej do kierunku promieniowania,
- gęstość promieniowania, �, jest to energia zawarta w 1 cm3
napromieniowanego układu.
Promieniowanie można podzielić:
- spolaryzowane liniowo,
- niespolaryzowane (promieniowanie naturalne),
- polichromatyczne (fale o różnej długości, czyli o różnej częstości),
3
- monochromatyczne (fale o jednej długości).
Polaryzacja fali elektromagnetycznej przy przejściu przez
drabinkę z drutów
Polaryzacja kołowa
Fala spolaryzowana kołowo Fala spolaryzowana kołowo
prawoskrętnie. lewoskrętnie.
http://pl.wikipedia.org/wiki/Polaryzacja_fali
W jakich warunkach promieniowanie elektromagnetyczne
zachowuje się jak fala?
1) Zjawisko dyfrakcji - to zjawisko zmiany kierunku rozchodzenia się fali na
krawędziach przeszkód oraz w ich pobliżu.
2) Zjawisko interferencji - to zjawisko nakładania się fal prowadzące do
zwiększania lub zmniejszania amplitudy fali wypadkowej.
Zjawisko dyfrakcji zachodzi dla przeszkód o dowolnej wielkości, ale
najbardziej widoczne jest przeszkód o rozmiarach porównywalnych z
długością fali. Zjawisko dyfrakcji to można wyjaśnić w oparciu o zasadę
Huygensa (czytaj: hojchensa). Po przejściu przez jedną i wąską szczelinę,
światło, które rozchodzi się prostoliniowo (jest falą płaską), zmienia się w falę
kulistą, rozchodzącą się we wszystkich kierunkach. Gdy szczelin jest kilka,
ugięte pod różnymi kątami fale cząstkowe nakładają się na siebie
(interferują), tworząc obraz złożony z wzmocnień i wygaszeń (tzw. prążki
interferencyjne)  doświadczenie Younga.
http://pl.wikipedia.org/wiki/Plik:Young.gif
W jakich warunkach promieniowanie elektromagnetyczne
zachowuje się jak strumień fotonów?
1) Zjawisko fotoelektryczne - zjawisko fizyczne polegające na emisji
elektronów z powierzchni przedmiotu (tzw. efekt zewnętrzny) lub na
przeniesieniu nośników ładunku elektrycznego pomiędzy pasmami
energetycznymi (tzw. efekt wewnętrzny), po naświetleniu jej promieniowaniem
elektromagnetycznym (na przykład światłem widzialnym) o odpowiedniej
częstotliwości, zależnej od rodzaju przedmiotu.
Wyjaśnienie efektu fotoelektrycznego zewnętrznego
podał A. Einstein (w 1905 r.; w 1921 r nagroda Nobla).
Światło należy traktować jak strumień cząstek
(fotonów). Każdy foton posiada energię E=h�=hc/l,
gdzie h  stała Plancka 6,62x10-34 [Jxs] , � 
częstotliwość światła. Efekt fotoelektryczny jest więc
wynikiem zderzenia dwóch cząstek: fotonu z
elektronem obecnym w metalu. Dla takiego zderzenia
Einstein napisał zasadę zachowania energii w postaci:
h"� = W + Emax, gdzie h"�  jest energią padającego
Efekt fotoelektryczny zewnętrzy
fotonu, W  pracą wyjścia, natomiast Emax.  jest
physics.tutorvista.com
maksymalną energią kinetyczną elektronu jaką może
on uzyskać po wyrwaniu się z fotokatody.
2) Efekt Comptona (zjawisko Comptona, rozpraszania komptonowskie) -
zjawisko rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (X) i promieniowania
gamma, czyli promieniowania elektromagnetycznego o dużej częstotliwości, na
cząstkach naładowanych, w wyniku czego następuje zwiększenie długości fali
promieniowania.
W swoich doświadczeniach Compton stosował wiązkę promieniowania
rentgenowskiego o ściśle określonej długości fali 1 i kierował ją na grafitową
tarczę. Dla różnych kątów rozproszenia mierzył on natężenie rozproszonego
promieniowania rentgenowskiego w funkcji długości fali.
2
1
Natężenie wiązki rozproszonej pod kątem
w zależności od długości fali.
http://www.ftj.agh.edu.pl/~wolny/Wcaa4b56e8970d.htm
3) Promieniowanie ciała doskonale czarnego
Zależność Plancka łączy naturę falową i korpuskularną
promieniowania poprzez określenie cechy korpuskularnej, jaką jest
wielkość fotonu, za pomocą cechy falowej, jaką jest częstość � (ilość
drgań na sekundę) lub liczba falowa � (ilość drgań na centymetr).
E = h� = hc/l
Wyrażenie h to stała Plancka. Wynosi ona 6,62�10-34 J�s
8
Rys. Widmo promieniowania elektromagnetycznego.
9
http://pl.wikipedia.org/w/index.php?title=Plik:EM_Spectrum_Properties_pl.svg&filetimestamp=20080419202558
10
Formy energii molekuł
11
12
13
Kwantowanie energii
Formy energii molekuły zmieniają się skokowo, w sposób
nieciągły. Dana molekuła może oddawać otoczeniu swą
energię tylko charakterystycznymi porcjami, kwantami. To
samo dotyczy pobierania przez molekułę energii z
otoczenia: tylko kwanty energii charakterystyczne dla danej
molekuły mogą być przez nią pochłonięte, kwanty mniejsze
lub większe nie są przez molekułę pochłaniane.
Pochłanianie lub emitowanie kwantów energii oznacza
przenoszenie się układu odpowiednio na wyższe lub niższe
poziomy energetyczne. Układ nie może znalez
ć się w
stanie, któremu odpowiadałaby wartość energii pomiędzy
jego poziomami energetycznymi.
http://www.wsp.krakow.pl/biofiz/pr
ezentacja/tresc/czastecz.htm
Rys. Modelowe przedstawienie rozkładu poziomów energetycznych w atomie wodoru.
Atom posiada szereg poziomów energetycznych. Stan o najniższej energii czyli taki, w
którym zbiór elektronów otaczających jądro przyjmuje najmniejszą możliwą wartość
energii nazywa się stanem podstawowym atomu, pozostałe zaś stanami wzbudzonymi.
Na rysunku przedstawiono schematycznie rozkład poziomów energetycznych w atomie
wodoru. Atom może znalez
ć się w stanie wzbudzonym (np. E2, E3, E4) pobierając z
otoczenia (absorbując) energię tylko określonymi porcjami. Te porcje energii nazywamy
kwantami.
Powrót do stanu podstawowego jest związany z emisją kwantu promieniowania
elektromagnetycznego - fotonu o energii hv równej różnicy energii poziomu
wzbudzonego (np. E2) i podstawowego E1.
E2 - E1= hv
Do przedstawienia poziomów energetycznych i przejść elektronowych w
dwuatomowych molekułach używamy krzywych potencjału Morse'a.
Krzywa Morse'a jest funkcją opisującą zmiany energii potencjalnej cząsteczek
w zależności od wzajemnej odległości jąder.
http://www.wsp.krakow.pl/biofiz/prezentacja/tresc/czastecz.htm
Rys. Krzywe energii potencjalnej stanu podstawowego E1 cząsteczki dwuatomowej.
A, B - oznaczenia atomów wchodzących w skład cząsteczki;
R1 - odległość, przy której cząsteczka ulega dysocjacji.
Gdy cząsteczka zaabsorbuje foton, przechodzi na wyższy poziom
energetyczny. Krzywa energii potencjalnej stanu wzbudzonego ma
minimum, co umożliwia utrzymanie się molekuły w tym stanie przez
pewien czas.
Rys. Krzywe energii potencjalnej cząsteczki dla stanu podstawowego E1 i wzbudzonego E2.
Procesy towarzyszące powrotowi cząsteczek do stanu
podstawowego. Diagram Jabłońskiego
http://pl.wikipedia.org/wiki/Diagram_Jabło
ńskiego
Współczesna wersja
diagramu Jabłońskiego
Czynniki determinujące kształt i szerokość konturu
pasma
Widmo absorpcyjne  powstaje podczas
przechodzenia promieniowania
elektromagnetycznego przez ośrodek
absorbujący promieniowanie o określonych
długościach fali.
Widmo emisyjne  jest obrazem
promieniowania elektromagnetycznego,
wysyłanego przez ciało.
19
1) rozmycie skwantowanych poziomów energetycznych, między
którymi następuje przejście absorpcyjne lub emisyjne
20
2) efekt Dopplera
3) efekt Lorentza
4) oddziaływania międzycząsteczkowe
5) niedoskonałość układu optycznego
21
Intensywność integralna =prawdopodobieństwo przejścia
22
między rozmytymi poziomami
23
Autor: prof. K. Kurzak
(a) Efekt oddziaływania promieniowania z atomami i cząsteczkami;
(b) spektroskopowe metody instrumentalne.
24
W jaki sposób rejestrujemy widmo?
PRÓBKA
25
Widma oscylacyjne
(widma w podczerwieni FT-IR i
widma ramanowskie FT-Raman)
Model oscylatora harmonicznego
27
potencjalna energia oscylacji
częstość drgań oscylatora
harmonicznego
28
Rozwiązanie równanie SchrQ
dingera dla harmonicznego oscylatora molekularnego
daje energie skwantowanych stanów oscylacyjnych w postaci:
29
Molekuła jako oscylator anharmoniczny
" w praktyce spektroskopowej mamy z reguły do czynienia z przejściami między
poziomami o małych liczbach V, dlatego też często stosujemy przybliżenie
oscylatora harmonicznego,
" ważnym skutkiem anharmoniczności jest rozszerzenie reguł wyboru dla
oscylatora harmonicznego
30
" Przejścia absorpcyjne z poziomu zerowego na pierwszy poziom "V=+1 nazywa
się tonem podstawowym i jest najbardziej prawdopodobne, czyli
odpowiadające mu pasmo na widmie na największą intensywność.
" Przejścia "V=+2 nazywa się pierwszym nadtonem, "V=+3 drugim nadtonem,
itd. Prawdopodobieństwo przejść maleje w miarę wzrostu "V i odpowiednie
pasma w widmie mają coraz mniejszą intensywność.
" Przejścia absorpcyjne z poziomu pierwszego na wyższe mają niewielki udział w
widmie. Możliwe jest to w wyższych temperaturach, gdy wzrośnie obsadzenie
wyższych poziomów oscylacyjnych. Pojawiające się pasma przejść
 niezerowych nazywają się pasmami gorącymi.
31
Drgania molekuły
rozciągające symetryczne
rozciągające asymetryczne nożycowe wahadłowe
symmetrical stretching
asymmetrical stretching scrissoring rocking
wachlarzowe skręcające
wagging twisting
32
Drgania normalne cząsteczki wody
n=3
3n-6 = 3*3-6 = 3
" Jądra molekuł wieloatomowych wykazują oscylacje zmieniające długości wiązań
i kąty między nimi. Oscylacje molekuły n-atomowej są równe:
3n-5 (cząsteczka o budowie liniowej)
3n-6 (cząsteczka o budowie nieliniowej)
oscylacjom harmonicznym.
" Drgania normalne to jednoczesny ruch wszystkich zrębów atomowych molekuły
odbywający się z jednakową częstością i w zgodnej fazie.
33
Drgania normalne grupy -CH2
W każdym drganiu biorą udział wszystkie zręby atomowe molekuły. Jeśli mówimy, że
jakaś częstość jest charakterystyczna dla danego ugrupowania atomów w molekule,
to jest to przybliżenie.
34
Reguły wyboru dla przejść w spektroskopii w podczerwieni
(jakie warunki muszą być spełnione, aby możliwa była jest
rejestracja widma w podczerwieni)
1) Fotony promieniowania musza mieć energie równą
różnicy energii poziomów energetycznych E= h� �
2) Przejście zachodzi tylko wtedy, gdy kwantowa liczba
oscylacji zmienia się o 1, 2, 3 &
3) Przejścia między stanami kwantowymi są widoczne
tylko dla takich oscylatorów, w których w czasie drgania
zmienia się moment dipolowy molekuły.
35
Przykładowe widma w podczerwieni FT-IR związków organicznych.
Czynniki zmniejszające liczbę pasm w widmie IR:
" oscylacje nieaktywne w podczerwieni,
" symetria molekuły, która powoduje degenerację niektórych poziomów
energetycznych
" pasma poza zwykłym zakresem rejestracji,
" słaba intensywność pasma, nakrywanie pasm.
Czynniki zwiększające liczbę pasm w widmie IR:
" pasma nadtonów, określa się jako 2�1, 3�2 itd., ponieważ występują one
przy częstościach w przybliżeniu równych wielokrotnej częstości pasm
podstawowych; ich intensywność stanowi 0,01-0,1 intensywności
odpowiedniego pasma podstawowego,
" pasma kombinacyjne, tony złożone, pojawiają się gdy następuje
jednoczesna absorpcja dużego fotonu na poziomach dwóch lub więcej
oscylatorów; zazwyczaj bardzo słabe pasma,
" rezonans Fermiego występuje wtedy, gdy drgania o zbliżonych częstościach
są ze sobą sprzężone, to znaczy wzajemnie ze sobą oddziałują
37
Schemat blokowy spektrofotometru dwuwiązkowego.
38
39
Techniki refleksyjne pozwalają otrzymać widma w podczerwieni poprzez pomiar
promieniowania odbitego od próbki. Do pomiaru promieniowania odbitego służą
rozmaite układy optyczne stosowane w przystawkach do spektrometrów.
Najbardziej typowe układy wykorzystują odbicie całkowite (zwierciadlane),
wielokrotne odbicie osłabione (attenuated total reflection, ATR) lub rozproszone
od niejednorodnych powierzchni (diffuse reflectance infrared fourier
transformed spectroscopy, DRIFT). Różne typy odbicia:
Rodzaje odbić w zależności od rodzaju powierzchni próbek: a) odbicie zewnętrzne, b) wielokrotne
odbicie wewnętrzne, c) odbicie rozproszone. Parametry n1 i n2 współczynniki załamania światła dla
różnych faz.
40
Jeśli na substancję pada promieniowanie może ono zostać pochłonięte wtedy
kiedy energia fotonu pasuje do różnicy poziomów energetycznych molekuły.
Mimo to promieniowanie może oddziaływać z molekułą w ten sposób, że ulegnie
rozproszeniu we wszystkich kierunkach w przestrzeni. I chociaż fotony nie są
absorbowane, to są one z biegnącej w określonym kierunku wiązki rozpraszane
w przestrzeń. Widmo rozproszenia jest widmem ramanowskim.
W promieniowaniu rozproszonym znajdują się obok fotonów o częstości równej
promieniowaniu padającemu, również fotony o częstościach różnych od
częstości promieniowania padającego.
Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888-1970), profesor Uniwersytetu w
Kalkucie, uzyskał nagrodę Nobla w 1930 roku za prace nad rozpraszaniem
światła i odkrycie zjawiska, które nazwane zostało jego nazwiskiem.
Promieniowanie padające na próbkę jest monochromatyczne (o jednej długości
fali). Jego z
ródłem jest laser pracujący przy długości fali z zakresu od ultrafioletu,
poprzez zakres widzialny, aż do podczerwieni.
Spektroskopia ramanowska może być stosowana zarówno do gazów, cieczy, jak i
ciał stałych.
Technika ta jest komplementarna do spektroskopii w podczerwieni.
Rodzaje pasm obserwowanych w widmie Ramana
" Pasma Rayleigha - powstające na skutek oddziaływania fotonów
padającego promieniowania o częstości �0, nie pasujących do poziomów
energetycznych cząsteczki. Gdy molekuła po oddziaływaniu z
promieniowaniem powraca na ten sam poziom energetyczny, to zjawisko to
sprowadza się do klasycznego rozproszenia Rayleigha.
" Pasma stokesowskie - gdy cząsteczka po oddziaływaniu z
promieniowaniem przenosi się na wyższy poziom oscylacyjny i rozproszony
foton ma energię mniejszą o różnicę energii poziomów oscylacyjnych h�.
" Pasma antystokesowskie - jeśli przed oddziaływaniem z
promieniowaniem molekuła znajdowała się na wzbudzonym poziomie
oscylacyjnym, to oddziaływanie przenosi ją na podstawowy (zerowy)
poziom oscylacyjny. Energia rozproszonego fotonu jest większa o różnicę
energii poziomów oscylacyjnych h�. Pasmo antystokesowskie pojawia się w
widmie Ramana po przeciwnej stronie co pasmo stokesowskie w stosunku
do pasma Rayleigha. Pasmo to ma zwykle niższą intensywność niż pasma
stokesowskie.
Rozpraszanie ramanowskie
Całkowite widmo ramanowskie składa się z:
- maksimum rozpraszania Rayleigha (duże natężenie, długość fali taka sama jak
długość fali wzbudzającej),
- szeregu maksimum stokesowskich (niższe częstotliwości, większe długości fali),
- szeregu maksimów antystokesowskich (wyższe częstotliwości, mniejsze długości
fali).
Widmo Ramana
przedstawia zależność
intensywności sygnału od
częstości (liczby falowej),
będącej różnicą między
częstościami (liczbami
falowymi) promieniowania
padającego a rozproszonego
(przesunięcie Ramana).
Reguły wyboru - różnice
Polaryzowalność to zdolność przemieszczania się elektronów względem jąder
w polu elektrycznym. Polaryzowalność jest tym większa im słabiej związane są
elektrony walencyjne ze szkieletem zrębów atomowych, im bardziej ruchliwe
są elektrony w molekule.
Kryterium spektroskopowe jonowości wiązania,
które mówi, że jeżeli rośnie intensywność pasma
w podczerwieni, a widmie Ramana maleje, to
oznacza to, że odpowiednie wiązanie w molekule
staje się bardziej spolaryzowane. I na odwrót,
jeżeli rośnie intensywność pasma
ramanowskiego, a maleje intensywność pasma w
IR, to ma to oznaczać wzrost kowalencyjności
odpowiedniego wiązania.
Oscylacje CO2
Widmo IR i Ramana CO2
2349
667
1343
oscylacyjnych
W spektroskopii Ramana stosuje się obecnie wiele nowych technik,
które przede wszystkim zwiększają czułość tej metody, np.
" Rezonansowa spektroskopia Ramana (Resonance Raman
Spectroscopy, RRS)
" Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana (Surface
Enhanced Raman Spectroscopy, SERS)
" Konfokalna mikroskopia ramanowska (Confocal Raman
Microscopy)
" Wymuszona (nieliniowa) antystokesowska spektroskopia Ramana
(Coherent Antistokes Raman Spctroscopy, CARS)
Spektroskopy IR
Spektroskopy Raman
Zastosowanie spektroskopii Ramana i IR w
medycynie
" Diagnostyka miażdżycy
" Diagnostyka osteoporozy
" Diagnostyka chorób skóry
" Diagnostyka chorób nowotworowych
" Diagnostyka chorób Parkinsona, Alzheimera
" Diagnostyka kamicy nerkowej
Zastosowanie spektroskopii Ramana
RRS może być techniką przydatną w wielu różnorodnych dziedzinach
nauki - zarówno do badań strukturalnych przy określaniu struktury
cząsteczki na podstawie pasm charakterystycznych obecnych w widmie
jak i analitycznych do określania ilości badanej substancji w żywej tkance,
gdy pomiar inną techniką jest niemożliwy. Jeszcze innym zastosowaniem
jest wykorzystanie połączenia między mikroskopią, a spektroskopią, które
umożliwia wykorzystanie spektroskopii Ramana do obrazowania tkanek.
Zastosowanie spektroskopii RRS
Spektroskopia RRS podobnie jak RS znajduje wiele potencjalnych
zastosowań w medycynie. Używana jest jako nieinwazyjna metoda
pobierania próbek do analizy. Można tą techniką wykonywać badania ex
vivo i en vivo na żywych tkankach, stosowana m.in. do pomiarów stężenia
glukozy we krwi, diagnozowania tkanek, badań komórkowych, obrazowania
obszarów normalnie niedostępnych dla badaczy (ludzki hipokamp),
diagnozowania zmian nowotworowych oraz przy identyfikacji rozkładu
barwników w skórze.
Zastosowanie spektroskopii RRS
Dzięki dużej czułości na niewielkie zmiany strukturalne (szybkie zmiany
konformacyjne) spektroskopia Ramana znajduje zastosowanie w
badaniach dynamiki procesów enzymatycznych, mechanizmu widzenia
oraz przebiegu fotosyntezy, czy oddychania komórkowego. Może być
również nieocenionym narzędziem przy ustalaniu struktury
przestrzennej wielu skomplikowanych biopolimerów zawierających w
swej cząsteczce grupy chromoforowe (m.in. cytochrom, porfiryny,
karoteny, DNA).
Medycyna, diagnostyka
Spektroskopię Ramana można wykorzystać do badania skóry, pod kątem
śledzenia zmian w strukturze biochemicznej, w tym do diagnostyki
nowotworów. Wyniki badań spektroskopowych prowadzonych przez
Gniadecką i innych wskazują na zmiany w strukturze białek i lipidów w
próbkach skóry objętej procesem nowotworowym.
Medycyna, diagnostyka
Różnice spektralne między widmami zdrowej i chorej tkanki obserwowane
są na pasmach charakterystycznych białek: amid I (1640-1680 cm-1), amid
III (1220-1300 cm-1) i �C-C (928-940 cm-1) oraz lipidów: �(CH2)  (1420-1450
cm-1) i skręcających  (CH2)n (ok. 1300 cm-1). Ponadto między tkanką
chorą a zdrową występuje również różnica w obszarze 840-860 cm-1, co
odpowiada różnicom w strukturze polisacharydów.
Medycyna, diagnostyka
Spektroskopię Ramana w połączeniu ze spektroskopią fluorescencyjną
zastosowano w diagnostyce in vivo bielactwa nabytego. Bielactwo nabyte
jest przewlekłą chorobą polegającą na depigmentacji fragmentów skóry na
skutek wymierania komórek barwnikowych skóry  melanocytów. Dokładny
mechanizm powstawania plam bielaczych nie jest znany. Teorie
powstawania tych zmian koncentrują się na trzech mechanizmach:
autoimmunologicznym, autocytotoksycznym i związanym z układem
nerwowym (neurogenny).
Skóra dotknięta bielactwem
Medycyna, diagnostyka
Schallreuter i współpracownicy donoszą, że wykorzystując
spektroskopię Ramana z transformacją Fouriera zidentyfikowali
obecność nadtlenku wodoru (H2O2) w stężeniu milimolowym w skórze
osoby chorej (zarówno w obszarze objętym pigmentacją jak i poza
nim). Dodatkowo wykorzystując spektroskopię fluorescencyjną wykryli
spowodowane przez H2O2 utlenianie reszt tryptofanowych w
obszarze depigmentacji (co prowadzi do zniszczenia komórek
melanocytów).
Otrzymane wyniki stanowią
potwierdzenie dla teorii
autocytotoksycznej (według której
zniszczenie melanocytów powoduje
jakiś czynnik obecny w tych
komórkach  w tym przypadku
H2O2) i wskazują efektywną
metodę diagnostyki bielactwa.
Medycyna, diagnostyka
Spektroskopię Ramana w połączeniu z mikroskopem konfokalnym oraz
spektroskopią w podczerwieni wykorzystano do scharakteryzowania
łuszczycy in vitro. Jest to przewlekła choroba skóry z tendencją do
samoistnego ustępowania objawów i ich nawrotów. Jej charakterystyczną
cechą jest występowanie łuszczących się wykwitów. Bernard i in. badali
warstwę rogową skóry odpowiedzialną za przepuszczalność naskórka. W
przypadku pacjentów cierpiących na łuszczycę stwierdzono zwiększoną
przepuszczalność i spadek grubości warstwy rogowej naskórka w
porównaniu do osób zdrowych. Ta korelacja jest istotna w lepszym
zrozumieniu patogenezy choroby, a ponadto może znalez
ć zastosowanie w
monitorowaniu klinicznego leczenia łuszczycy i przewidywania nawrotu
objawów choroby.
Medycyna, diagnostyka
Spektroskopia Ramana jest metodą o potencjalnych możliwościach
wykorzystania w badaniach diagnostycznych miażdżycy naczyń
wieńcowych przeprowadzanych in vivo. Przemawiają za tym przede
wszystkim możliwości szybkiego zbierania danych i niemal
natychmiastowe otrzymanie wyniku.
Medycyna, diagnostyka
W kilku pracach zaprezentowano, że na podstawie matematycznego
modelu porównywania między naczyniem zdrowym a miażdżycowo
zmienionym, można z widm Ramana uzyskać ilościową informację o
chemicznym składzie komponentów powodujących zwężenie tętnic.
Technika ta daje nie tylko możliwość sklasyfikowania zmian
miażdżycowych w tętnicach wieńcowych, dostarcza również informacji
o cechach morfologicznych, takich jak obecność komórek
piankowatych, zmian martwiczych i kryształów cholesterolu, które
mogą być użyte do oceny niestabilności blaszek, przewidywania
postępu choroby i możliwości wystąpienia groz
nych komplikacji (np.
ostrego zespołu wieńcowego).
Medycyna, diagnostyka
Jedne z pierwszych widm naczyń tętniczych metodą
spektroskopii Ramana wykonali Rava i in.
przypisując charakterystyczne pasma elementom
strukturalnym budującym naczynia. De Paula i in.
przypisali w widmie ramanowskim zdrowej tętnicy
dominujące pasma przy 1660, 1452 i 1260 cm-1
białkom strukturalnym: kolagenowi i elastynie.
W przypadku widma tętnicy z blaszkami miażdżycowymi występują pasma
1442 i 1665 cm-1 cholesterolu i jego estrów, głównych budulców blaszek
miażdżycowych. Widmo Ramana zwapniałych blaszek miażdżycowych
wykazuje znaczne różnice w stosunku do dwóch poprzednich  główne
pasma: 962 i 1073 cm-1 pochodzą od związków wapnia.
Medycyna, diagnostyka
W zastosowaniach biologicznych i medycznych spektroskopia Ramana ma tę zaletę,
że widma zawierające dużą ilość informacji możemy otrzymać z nienaruszonej tkanki, a
więc bez ingerencji w jej strukturę. Wobec tego możliwa jest szczegółowa analiza
chemiczna materiału biologicznego, mimo wysokiej jego złożoności. Inną korzystną
właściwością spektroskopii Ramana jest czułość nawet na małe zmiany strukturalne.
Dzięki temu możliwe są badania porównawcze między zdrową a chorobowo
zmienioną tkanką. Istotną zaletą spektroskopii Ramana jest także mała intensywność
pasm wody, która w podczerwieni bardzo utrudnia analizę materiału biologicznego.
Zdjęcia mikroskopii Ramanowskiej badania apoptozy w żywych komórka MCF-7.
Obrazy są oparte na widmie Ramana składników komórek i ich apoptoza jest
monitorowana przez dyfuzję cytochromu c w cytoplazmie. J. Biomed. Opt. 18(5), 056010
(May 09, 2013).
Medycyna, diagnostyka
Inżynierowie biomedyczni z Uniwersytetu w Michigan w 2000 roku
opracowali sposób na precyzyjne przewidzieć osłabienia kości.
Naukowcy użyli spektroskopii Ramana do identyfikacji zmian
chemicznych w kości, które są związane z mikrouszkodzeniami
mechanicznymi.
Fotografie Spektroskopii Mikroskopowej kości wołowej uszkodzonej i
bez uszkodzeń.
Medycyna, diagnostyka
Od 2005 roku pojawiają się doniesienia o możliwości wykorzystania
spektroskopii Ramana w diagnostyce osteoporozy. W standardowej
procedurze diagnostyki osteoporozy materiał używany do badań
pochodzi z kości (badanie gęstości kości), natomiast Towler i in.
wykorzystali do badań nietypowy materiał  płytkę paznokci. Prace
grupy Towlera wykazały, że ilość wiązań disiarczkowych w paznokciach
osób chorych na osteoporozę jest mniejsza niż w paznokciach osób
zdrowych. Wyniki takie nasuwają przypuszczenie, że istnieje korelacja
między mechanicznymi i chemicznymi właściwościami kości i płytki
paznokci.
Medycyna, diagnostyka
Sugeruje to, że zmiany w macierzy organicznej kości, a więc w jej głównym
białku budulcowym kolagenie, mają swoje odbicie w strukturze keratyny 
pokrewnego białka będącego składnikiem paznokci. Kolagen i keratyna,
pomimo że są różnymi białkami, mają jedną wspólną cechę: dużą
zawartość reszt cysteinowych i w związku z tym dużą ilość wiązań
disiarczkowych warunkujących wytrzymałość tkanek. Z badań Dittmara i in.
wiadomo natomiast, że ilość siarki w płytce paznokci pozostaje stała
niezależnie od wieku. Zatem liczba  miejsc , w których mogą utworzyć się
wiązania S S jest stała, ale u osoby chorej na osteoporozę liczba tych
wiązań maleje w porównaniu z osobą zdrową.
Na widmie ramanowskim paznokci
osób chorych następuje więc
obniżenie intensywności pasma,
charakterystycznego dla drgań
rozciągających wiązania S S przy ok.
510 cm-1 w stosunku do wartości
otrzymanej dla osób zdrowych.
Medycyna, diagnostyka
Spektroskopia Ramana, jako metoda diagnostyki raka, stała się
przedmiotem zainteresowania wielu grup naukowców. Przeprowadzono
szereg badań pod kątem wykorzystania tej metody w diagnostyce
nowotworów m.in. piersi, gardła, płuc, skóry, jelita grubego, nerek, szyjki
macicy i wielu innych. Niemal w każdym przypadku otrzymane wyniki są
bardzo obiecujące, potwierdzają duże możliwości, jakie spektroskopia
Ramana daje w diagnostyce chorób nowotworowych in vitro, ale co
ważniejsze również in vivo.
Medycyna, diagnostyka
Raman spectra of normal and cancerous skin. L. Silveira i in. Proc. SPIE, Vol. 8207 (2012)
Medycyna, diagnostyka
Widmo Ramana zarejestrowane dla tkanki zdrowej żołądka i tkanki raka żołądka różni
się położeniem pasm i ich intensywnością. Wskazuje to na możliwość użycia widma
Ramana do diagnostyki raka żołądka. Główne różnice dotyczą pasm pochodzących
od grup amidowych I-rzędowych, grup  CH2 i amidowych III-rzędowch.
Rys. Widmo Ramana tkanki żołądka, z komórkami zdrowymi (linia ciągła) i dla komórek
zmienionych nowotworowo (linia przerywana)
Medycyna, diagnostyka
Rys. Widma Ramana tkanek jelita grubego: zdrowej (Normal), z polipami (Polyps), z
gruczolakorakiem (Cancer).
Optyczna biopsja z wykorzystaniem spektroskopii Ramana może być korzystną
alternatywą, dla badań kolonoskopowych w badania przesiewowym w kierunku raka
jelita grubego.
Medycyna, diagnostyka
Widmo Ramana i zdjęcia mikroskopowe tkanki A zdrowej piersi, B tkanki ze zmienionymi
fibrocystami
Medycyna, diagnostyka
Widmo Ramana i zdjęcia mikroskopowe tkanki C zaatakowanej gruczolakowłókniakiem D
zmienionej nowotworowo
Medycyna, diagnostyka
Za pomocą spektroskopii Ramana można badać również białą i szarą
istotę mózgu. Tą metodą uzyskuje się istotne informacje w diagnostyce
takich chorób, jak choroba Parkinsona czy Alzheimera, poprzez
porównanie między tkanką zdrową i objętą chorobą. Wykonując badania
tkanki mózgowej osoby cierpiącej na Alzheimera, stwierdzono obecność
sygnału przy 1628 cm-1 pochodzącego od białka �-amylazy,
podejrzewanego o wywołanie choroby Alzheimera.
Spektroskopia Ramana może być stosowana również w diagnostyce
kamicy nerkowej. Pozwala na wykrycie kamieni zarówno typu
szczawianowego, jak i powstałych w wyniku redukcji cysteiny do cystyny.
Dla tych drugich otrzymujemy widma z sygnałami charakterystycznymi
dla cystyny: 498 cm-1 pochodzącym od drgań wiązań S-S i 677 cm-1 od
drgań rozciągających wiązań C-S. Analiza ta dostarcza szybkich i
rzetelnych informacji o rodzaju powstałych kamieni.
Schemat spektrometru Ramana do badań In vivo
Biochemia
Dzięki dużej czułości na niewielkie zmiany strukturalne (szybkie zmiany
konformacyjne) spektroskopia Ramana znajduje zastosowanie w badaniach
dynamiki procesów enzymatycznych, mechanizmu widzenia oraz przebiegu
fotosyntezy czy oddychania komórkowego. Może być również
nieocenionym narzędziem przy ustalaniu struktury przestrzennej wielu
skomplikowanych biopolimerów zawierających w swej cząsteczce grupy
chromoforowe (m.in. cytochrom, porfiryny, karoteny, DNA).
Farmacja
Warto również wspomnieć, że spektroskopia oscylacyjna znajduje
zastosowanie nie tylko w medycynie, ale również w farmacji  służy
m.in. do badania procesu uwalniania substancji leczniczej ze stałych
postaci leków, w szczególności z nowych nośników substancji
leczniczych oraz do badania penetracji tkanek przez uwolnione leki.
Badania te są aktualnie wykonywane głównie in vitro, ale po
zapewnieniu odpowiednich środków bezpieczeństwa mogą być
wykonywane in vivo.
Spektroskopia NMR
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopia
NMR (ang. Nuclear Magnetic Resonance) to jedna z najczęściej
stosowanych technik spektroskopii absorpcyjnej w chemii, biotechnologii i
medycynie.
1 2 13 15 19 31
Niektóre jądra atomowe posiadają spin jądrowy (np. H, H, C, N, F, P
 o nieparzystej liczbie nukleonów). W wyniku obrotu takich jąder pojawia się
moment pędu �. Moment pędu wirującego ładunku to tzw. spin. Spin
definiuje kwantowa liczba spinowa I = 0, �, 1, 1� itd., przy czym, gdy I = 0,
1 2 13 15 19 31
to mamy brak spinu. Jadra atomowe o I = � (np. H, H, C, N, F, P )
mają sferyczny rozkład ładunku i w zewnętrznym polu magnetycznym
przyjmują dwa ustawienia +� lub -� są to tzw. jądra magnetyczne.
N
� +
S
Atom pierwiastka jest Spiny jądrowe (a) przy braku zewnętrznego pola magnetycznego,
dipolem magnetycznym. (b) w obecności zewnętrznego pola magnetycznego Ho McMurry, J.,
2010. Chemia organiczna. T. 3. Wydawnictwo Naukowe PWN
Wykres widma NMR  wykres zależności intensywności absorpcji
promieniowania od natężenia zewnętrznego pola magnetycznego.
13 31
Najczęściej rejestruje się widma wodoru ąH NMR, węgla C NMR i fosforu P
NMR.
McMurry, J., 2010. Chemia organiczna. T. 3. Wydawnictwo Naukowe PWN.
Na widmie uzyskuje się dużą liczbę sygnałów, których położenie odzwierciedla
1
różnice w położeniu protonów (jeśli mówimy o widmie H NMR) i dostarcza
informacji o strukturze cząsteczki.
Położenie sygnałów w widmie NMR
Przesunięcie chemiczne
1
Liczba sygnałów na widmie H NMR informuje nas o tym, ile rodzajów atomów
wodoru znajduje się cząsteczce, natomiast położenie sygnałów wskazuje, jakiego
typu są to atomy.
Co decyduje o tym, że sygnały pojawiają się różnym miejscu na widmie?
Jednym z powodów jest ekranowanie jądra.
Schemat przedstawia gęstość elektronową wokół
wiązania C-H. To jaka jest gęstość elektronowa
wokół wodoru zależy od rodzaju atomu Z
przyłączonego do węgla. Ze wzrostem
elektroujemności atom Z spada gęstość elektronowa
zgromadzono wokół H, i odwrotnie  jeśli Z jest
elektronodonorową grupą powoduje to wzrost
gęstości elektronowej wokół H.
W molekułach aromatycznych występuje efekt
wynikający z delokalizacji aromatycznych
elektronów Ą na dużym obszarze pierścienia. Pod
wpływem zewnętrznego pola magnetycznego
elektrony Ą krążą po całym pierścieniu, co
wywołuje indukowanie dużego momentu
magnetycznego. Na protony leżące na obrzeżu
pierścienia działają linie sił skierowane zgodnie z
kierunkiem zewnętrznego pola magnetycznego.
Protony aromatyczne są więc silnie
odekranowane (odsłaniane).
Do osiągnięcia określonej wartości natężenia pola, przy którym następuje absorpcja,
przesłaniany proton wymaga większego, a odsłaniany mniejszego natężenia pola
zewnętrznego niż proton nieekranowany (pozbawiony otoczenia elektronowego).
Przesłanianie protonu  przesunięcie sygnału absorpcji w kierunku większego
natężenia pola, a odsłaniania  w kierunku mniejszego natężenia pola.
Przesunięcie położenia sygnału na widmie NMR, wynikające z przesłaniania lub
odsłaniania przez elektrony, nazywa się przesunięciem chemicznym.
W jaki sposób można oznaczyć i opisać kierunek oraz wartość
przesunięcia chemicznego?
Przesunięcie chemiczna wyraża się w jednostkach ppm (ang. part per million 
części na milion); 1 ppm = 10-6 natężenia całkowitego przyłożonego
(zewnętrznego) pola magnetycznego. Przesłanianie lub odsłanianie jest
skutkiem działania indukowanych pól i dlatego wielkość przesunięcia
chemicznego jest proporcjonalna do natężenia pola przyłożonego (lub do
częstotliwości radiowej, która w warunkach rezonansu (absorpcji) jest
uzależniona od natężenia pola). Jeśli przesunięcie chemiczne wyrazi się
ułamkiem natężenia przyłożonego pola (czyli jeśli obserwowane przesunięcie
podzieli się przez zastosowaną częstotliwość radiową), to przesunięcie
chemiczne będzie miało wartość, która nie zależy ani od częstotliwości
radiowej, ani od natężenia pola wytwarzanego przez spektrofotometr NMR.
5�\�5�O�5�`�5�R�5�_�5�d�5�\�5�d�5�N�5�[�5�R� 5�]�5�_�5�g�5�R�5�`�5�b�5�[�5�V�ę5�P�5�V�5�R� 5�;�5�g� " 106
5��� =
5�P�5�g�ę5�`�5�a�5�\�5�a�5�Y�5�V�5�d�5�\�ść 5�`�5�]�5�R�5�X�5�a�5�_�5�\�5�S�5�\�5�a�5�\�5�Z�5�R�5�a�5�_�5�b� " 106 [5�;�5�g�]
Punktem odniesienia względem którego wyznacza się obserwowane
przesunięcie jest sygnał związku wzorcowego, zazwyczaj tetrametylosilanu
(CH3)4Si (w skrócie TMS). Najczęściej stosowaną skalą przesunięcia jest
chemicznego jest � (delta). Pozycję TMS przyjmuje się jako 0 ppm. Wartość �
większości przesunięć chemicznych znajduje się w zakresie 0  10 ppm.
R
NH
R
OH
R H
Ph
Me
OH
(R)
Me Si Me
TMS =
HO CH3 Ph CH3
Me
R R
R
R O R
O
NR2 O
Cl
H
CH3
OCH3 CH3 CH3 CH3
H
H
R
TMS
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
d� �ppm
Downfield region Upfield region
of the spectrum of the spectrum
Liczba protonów a powierzchnia pod krzywą sygnału w
widmie NMR
Powierzchnia pod krzywą każdego sygnału NMR jest wprost proporcjonalna do liczby
protonów, które powodują powstanie tego sygnału. Rozważmy octan etylu, który ma
trzy rodzaje protonów w cząsteczce, CH3 obok grupy karbonylowej (3 protony
równocenne), CH2 po atomie tlenu oraz CH3 po grupie CH2. Stosunek wysokości
sygnałów pochodzących od każdej grupy protonów powinien być odpowiednio 3:2:3. Z
tej informacji możemy wnioskować, że sygnał pochodzący od protonów CH2 jest
najmniejszy. Aby rozróżnić dwa pozostałe grupy sygnałów możemy skorzystać ze slajdu
wcześniejszego pozwalającego przewidywać wartość przesunięć chemicznych. Sygnał
od grupa CH3 znajdującej się obok C=O powinien pojawić się przy ~ 2 ppm, a grupy CH3
stojącej obok CH2 przy ~ 1 ppm.
3H' S
O
O CH3
O
O
H3C O
H
H
O
3H' S
2 H'S
Sprzężenie spinowo - spinowe
Rozważmy przykład molekuły zawierającej dwa protony drugorzędowe i jeden
trzeciorzędowy. Pole magnetyczne jakie  odczuwa proton drugorzędowy jest nieco
silniejsze lub nieco słabsze od pola przyłożonego, wskutek oddziaływania spinu
sąsiedniego protonu trzeciorzędowego. Silniejsze, jeśli w danej chwili orientacja
protonu trzeciorzędowego jest zgodna z kierunkiem linii sił pola przyłożonego, lub
słabsza  jeśli spin protonu trzeciorzędowego jest ukierunkowany przeciwnie do linii sił
pola przyłożonego. W związku z tym, w przypadku połowy wszystkich cząsteczek
związku następuje przesunięcie sygnałów absorpcji drugorzędowych protonów w
kierunku mniejszego natężenia pola, a w przypadku pozostałych w kierunku większego
natężenia pola. Na widmie uzyskujemy sygnał rozszczepiony na dwa piki o równej
intensywności, tzw. dublet.
Przyłożone pole Ho
Sygnał protonu
Kombinacje spinów
sąsiedniej grupy  CH-
H
H
Br C C H
Sygnały na widmie NMR od grupy -CH2Br
Br
Br
ppm
Na absorpcję protonów trzeciorzędowych wpływ ma spin sąsiednich protonów
drugorzędowych. Musimy wziąć pod uwagę orientację dwóch protonów względem linii
sił przyłożonego pola. Dlatego istniej cztery równie prawdopodobne kombinacje
ustawienia spinów tych protonów, w tym dwie z nich są równocenne. Proton
trzeciorzędowy odczuwa obecność każdego z tych trzech pól i jego sygnał zostaje
rozszczepiony na 3 piki, czyli na tryplet o względnej intensywności 1:2:1, w którym
podwojona intensywność środkowej linii odzwierciedla łączne (podwójne)
prawdopodobieństwo obu równoważnych kombinacji spinów.
Przyłożone pole Ho
Sygnał protonu
Kombinacje spinów
a b
sąsiedniej grupy  CH2-
H
H
b
Br C C H
Br
Br
a
ppm
Intensywność pików rozszczepionych sygnałów
protonów. Trójkąt Paskala.
relative intensities pattern example
no. of neighbors
0 1 singlet (s)
H H
1 1 1 doublet (d)
C C
H H
2 triplet (t)
1 2 1
C C H
H H
C C H
3 quartet (q)
1 3 3 1
H
H H H
C C C H
4 pentet
1 4 6 4 1
H
H H H
H C C C H
5 1 5 10 10 5 1 sextet
H
H H H
H C C C H
6 1 6 15 20 15 6 1 septet
H H
Aparatura NMR
900 MHz, 21.2 T NMR Magnet at HWB-NMR,
Spektrometr NMR Varian Unity Plus
Birmingham, UK
500 MHz, WCh, UW
Zastosowanie NMR w medycynie
Obraz NMR głowy
Aparat MRI (ang. magnetic resonance imaging)
Obraz NMR kręgosłupa szyjnego
Pytania:
1. Omów zjawisko dualizmu korpuskularno - falowego promieniowania
elektromagnetycznego. Jakie doświadczenia wskazują na charakter
falowy promieniowania, a jakie na charakter cząsteczkowy. Omów te
zjawiska.
2. Omów reguły wyboru dla przejść w spektroskopii w podczerwieni (jakie
warunki muszą być spełnione, aby możliwa była jest rejestracja widma w
podczerwieni)
3. Omów różnicę pomiędzy spektroskopią w podczerwieni i ramana.
4. Omów zastosowanie spektroskopii Ramana w badaniach medycznych,
podaj przykłady zastosowań.
5. Omów zasadę działania spektroskopii magnetycznego rezonansu
jądrowego.
6. Na dowolnym przykładzie scharakteryzuj sprzężenia spinowo-spinowe.
Opisz jak powstają.
7. Scharakteryzuj rodzaje pasm w widmie Ramana. Opisz jak (w jakich
warunkach) powstają poszczególne pasma.
Literatura:
1. Biofizyka, F. Jaroszyk, Wydawnictwo Lekarskie, PZWL.
2. Spektroskopia molekularna, J. Sadlej, Wydawnictwo Naukowo-
Techniczne
3. Podstawy Chemii Fizycznej, P.W.Atkins,, Wydawnictwo Naukowe
PWN,
4. Podstawy spektroskopii molekularnej, Z. Kęcki, Wydawnictwo PWN.