3582326696

Laboratorium biochemii

Kinetyka enzymatyczna I (ćw. A)

1.    Cel ćwiczenia

S Wyznaczenie podstawowych parametrów kinetycznych dla kwaśnej fosfatazy poprzez pomiar ilości powstałego produktu,

■S Ustalenie czy kwaśna fosfataza stosuje się do kinetyki Michaelis'a-Menten,

S Obliczenie stałej Michaela, szybkości maksymalnej oraz stałej szybkości reakcji.

2.    Odczynniki

S 0.25 M bufor octanowy o pH. 5.0 S 0.5 M wodorotlenek sodu

S 5 mM roztwór standardowy p-nitrofenolu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0 S 5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0 S Roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0,

C_e° = 0.08 mg/ml

3.    Szkło i aparatura

S probówki chemiczne S kolba ad 10 ml ^ pipety automatyczne oraz tipsy S kuwety S Specol

S termostat nastawiony na 37°C

4.    Wykonanie ćwiczenia

L Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu:

a)    Do 21 probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 1:

•    0.25 M buforu octanowego o pH 5.0

•    5.0 mM p-nitrofenylofosforan,

b)    Roztwory inkubowano przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37°C,

c)    Po czasie inkubacji do nieprimowanych probówek dodano roztwór fosfatazy,

d)    Próby 1-11 inkubowano w 37"C przez 25 min.,

e)    Po upływie czasu do wszystkich próbek dodano po 2 ml 0.5M roztworu NaOH,

f)    Zmierzono absorbancję roztworów przy A=410 nm względem próby 11.

2. Krzywa standardowa

a)    Otrzymany roztwór p-nitrofenolu rozcieńczono 50-krotnie w kolbie miarowej o pojemności 10 ml. Otrzymany roztwór dokładnie wymieszano i przelano do probówki „ P",

b)    Do 8 suchych probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 2.:

■    0.25 M bufor octanowy o pH 5.0,

■    O.lmM p-nitrofenol,

•    0.5 M NaOH