3582326699

Laboratorium biochemii

Profil Topnienia DNA (ćw K.)

1. Cel ćwiczenia

S Wykreślenie profilu topnienia roztworu kwasu dezoksyrybonukleinowego z grasicy cielęcej, S Wyznaczanie temperatury topnienia i przedziału temperaturowego denaturacji badanej próbki DNA, stopnia przeprowadzonej denaturacji DNA oraz hipochromizmu punktowego.

2. Odczynniki

S Roztwór SSC pH=7,0 (15mM NaCI, l,5mM cytrynian sodu),

S Próbka kwasu dezoksyrybonukleinowego - roztwór DNA w SSC,

S Olej parafinowy,

3.    Szkło i aparatura

S Pipety automatyczne oraz tipsy,

S Kuwety plastikowe,

S Kuwety kwarcowe,

S Spektrofotometr z termostatującą przystawką i mieszadłem magnetycznym,

S Termostat,

S Mieszadetko magnetyczne.

4.    Wykonanie ćwiczenia

S Do dwóch kuwet kwarcowych dodano po 3 ml 0,1 M roztworu SSC i wyzerowano spektrofotometr względem tych roztworów,

S Z kuwety „próbka" wylano roztwór SSC, następnie dodano 3 ml otrzymanego roztworu DNA wyizolowanego z grasicy cielęcej z ćwiczenia J,

S Zmierzono absorbancję roztworu DNA przy długości fali 260 nm oraz 280 nm, wyniki zamieszczono w Tabeli 1.,

•S Na powierzchnię roztworu w obu kuwetach ostrożnie nawarstwiono olej parafinowy,

S Rozpoczęto ogrzewanie próbek w spektrofotometrze,

5. Obliczenia i wyniki

A 260	A 280	Cdna [mg/ml]	Czystość DNA
0,7505	0,4135	0,037525	1,81

Tabela 1. - absorbancja natywnej formy DNA

•    Obliczanie stężenia badanego DNA: Cdna = 0,05 • A₂₆₀ = 0,037525 ĘŁ]

•    Obliczanie czystości DNA:

0,7505

0,4135

1,81