3582326697

Laboratorium biochemii

Preparacja DNA z grasicy cielęcej (ćw i)

1.    Cel ćwiczenia

✓    izolacja kwasu dezoksyrybonukleinowego z grasicy cielęcej.

2.    Odczynniki

✓    zamrożona grasica cielęca

/ ImM wersenian sodu (EDTA)

✓    roztwór SSC (0.015 M cytrynian sodu, 0.15 M chlorek sodu), pH 7.0

✓    0.15 M cytrynian sodu o pH 7.0

✓    20 % wodny roztwór SDS (dodecylosiarczan sodu) -4 ml

✓    NaCI - naważka 4 g

✓    mieszanina Savag'a (chloroform : alkohol amylowy = 24 : 1)

✓    95% zmrożony izopropanol (wydaje asystent tuż przed użyciem)

3.    Szkło i aparatura

✓    deseczka do krojenia grasicy

✓    skalpel

✓    homogenizator

✓    okulary i rękawiczki ochronne

✓    probówki wirówkowe z adapterami

✓    wirówka laboratoryjna

✓    waga techniczna

✓    termostat ustawiony na 55oC

✓    rozdzielacz

✓    zlewki ad. 250 i 400 ml

✓    cylinder miarowy

✓    pipety szklane

✓    pipety Pasteura S bagietki

4.    Wykonanie ćwiczenia

1.    Do naczynia homogenizatora wlano 25 ml roztworu SSC (0.015 M cytrynian sodu,

0.15M NaCI) o pH 7.0 i całość schłodzono w łaźni lodowej,

2.    Zamrożoną grasicę cielęcą pokrojono w 1 cm kawałki, wrzucono do schłodzonego roztworu SSC i homogenizowano przy maksymalnych obrotach przez 20 sekund.

3.    Homogenat przelano do jednej ze schłodzonych w lodówce probówek wirówkowych, drugą z probówek (przeciwwagę) wypełniono wodą.

4.    Probówki zrównoważono względem siebie na wadze technicznej,

5.    Wirowano homogenat przez 13 min. Przy 3500orb./min,

6.    Schłodzono 25ml roztworu SSC

7.    Odrzucono supernatant, a osad DNP rozprowadzono bagietką w 25 ml roztworu SSC, do uzyskania jednolitej zawiesiny

8.    Zawiesinę DNP przelano do probówki wirówkowej i zrównoważono na wadze względem przeciwwagi,

9.    Mieszaninę wirowane przez 13 min przy obrotach 3500/min.