Przedmiot: Nowoczesne Metody Analizy Żywności  temat 1
Prowadzący ćwiczenia: dr inż. Ewelina Hallmann sala 1095
(grupy 5, 2 i 7 termin 4 i 6.03.2013; grupy 6, 3 i 8 termin 11.03 i 13.03; grupy 4 i 1
termin 18.03 i 20.03)
Zakres realizowanej tematyki:
Teoretyczne i praktyczne zapoznanie z zasadą działania sprzętu do analizy HPLC
(wysokosprawnej chromatografii cieczowej), omówienie znaczenia poszczególnych
modułów urządzenia i ich udziału w analizie żywności. Zasady chromatograficznego
rozdziału karotenoidów. Ekstrakcja, oznaczenie jakościowe (ide ntyfikacja) oraz
ilościowe barwników karotenoidowych w wybranych warzywach i owocach z produkcji
ekologicznej i konwencjonalnej.
1. Podstawa teoretyczna ćwiczeń  chromatografia cieczowa
Chromatografia cieczowa, LC (ang. Liquid Chromatography) lub jej bardzie nowocześniejsza
wersja Wysokosprawna Chroatografia Cieczowa HPLC (ang. High Performance Liquid
Chromatography)  to zaawansowana metoda analityczna (oznaczanie ilościowe i jakościowe
związków) lub preparatywna (przygotowywanie i oczyszczanie wzorców) stosowana w
chemii. W chromatograii tej eluentem (nośnikiem) jest ciecz (zwykle jakiś rozpuszczalnik
organiczny). Istotą każdej analizy chromatograficznej w systemie cieczowym jest rozdział
analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez p rzepuszczanie
roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, podobnie jak w procesie sączenia. Na
skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę i
złożem, jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej, a inne wolniej.
Istnieje bardzo wiele rodzajów chromatografii cieczowej, które można podzielić na trzy
ogólne rodzaje:
chromatografia cienkowarstwowa (TLC) z ang. Thin Lyer Chromatography - w której
złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest nałożone na płytkę szklaną lub plast ikową w postaci
cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże
w specjalnej komorze na zasadzie podchodzenia (przenikania cieczy nośnika) w złoże płytki
szklanej. Identyfikacja związków odbywa się na podstawie roz winiętego chromatogramu
(plam, znaczników) w porównaniu do znanego wzorca (standardu).
1
Zależnie od rodzaju mieszaniny którą chcemy rozdzielić, poszczególne związki chemiczne -
składniki rozdzielanej mieszaniny przesuwają się na różną odległość na płytce (l ub na różną
wysokość) w zależności od usytuowania płytki (pokonaną drogę określamy mianem
współczynnika Rf z ang. response factor). Ważną cechą TLC jest znajomość współczynnika
Rf, co znacznie ułatwia identyfikację poszczególnych związków. Natomiast równomierność
rozmieszczenia plam substancji można charakteryzować ilościowo tzw. funkcjami CRF
(chromatographic response functions). W przypadku, gdy rozdzielone zwiÄ…zki z mieszaniny
nie są zabarwione, ich obecność można stwierdzić używając, zależnie od i ch właściwości,
światła UV (wkładamy płytki do specjalnej komory i podświetlamy lampą UV),. Można też
zastosować roztwory wywołujące (identyfikujące). Płytka z rozdzielanymi substancjami jest
zanurzana w takich roztworach lub używamy takiego roztworu jako spryskiwacza na
identyfikowanej powierzchni. Identyfikatory wywołują barwny, charakterystyczny dla
związku kompleks i na podstawie barwy i usytuowania plamy można zidentyfikować badany
związek chemiczny. Chromatografię TLC stosuje się głównie do jakościowe j identyfikacji
związków chemicznych, chociaż istnieją możliwości również ilościowego oznaczenia
rozdzielonych związków.
Fot. 1. Przykładowy chromatogram rozdziału barwników
w liściach szpinaku w systemie TLC
2
Fot. 1a. Komora TLC do rozdziału barwników
chlorofilowych w liściach szpinaku
chromatografia kolumnowa ( Column Chromatography). Jest to jedna z metod
chromatograficznych. Polega na rozdzieleniu mieszaniny poprzez wprowadzenie jej na stałą
fazę stacjonarną (adsorbent) zazwyczaj złoże jest w postaci krzemionki lub glinokrzemionki
umieszczonych w cylindrycznej kolumnie o określonej długości (wysokości) i rozdzieleniu jej
na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej (eluentu, czy fazy ruchomej), wprowadzanej z
odpowiedniego zbiornika lub dolewanej bezpośrednio na kolumnę. Przepływ eluentu może
być grawitacyjny (gdy pozwalamy swobodnie przenikać cieczy w dół kolumny i wymywać z
niej cząstki rozdzielanej mieszaniny) lub wymuszony przez zastosowanie pompy próżniowej
Składniki mieszaniny przemieszczają się ku dołowi kolumny z szybkością zależną od siły
oddziaływań ich cząsteczek z adsorbentem. Siła tych oddziaływań zależy od budowy
cząsteczek, dlatego poszczególne składniki mieszaniny przemieszczają się z różną
szybkością. Dzięki temu rozdzielone składniki można kolejno odbierać na dole kolumny.
Odparowanie rozpuszczalnika z odpowiednich porcji wycieku (frakcji) pozwala na uzyskanie
czystych składników mieszaniny. Metoda chromatografii kolumnowej ma zastosowanie w
jakościowym i ilościowym oznaczaniu związków chemicznych. W zależności od wielkości
kolumn i ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana
w skali analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.
3
Fot. 2. Przykładowy układ do chromatografii kolumnowej i
rozdział barwników w liściach szpinaku
Wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC (ang. High Performance Liquid
Chromatography)  odmiana chromatografii cieczowej, technika analityczna a także
preparatywna, stosowana do oczyszczania, badania czystości oraz identyfikacji związków
chemicznych. Jest to bardzo nowoczesny rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej.
Oznacza to, że analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym
rozpuszczalniku (ekstraknancie), zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu
(czasem jako ekstraknant stosuje się fazę ruchomą) i w formie roztworu o znanym stężeniu i
objętości jest kierowana na kolumnę, która wypełniona jest specjalnym złożem porowaty m
lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej lub mobilnej) pełni odpowiednio dobrana
mieszanina (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami
chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny nastę puje
ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów
retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe
powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez ko lumnę, zaś
związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają
szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej
złożone.
HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnien iem pod jakim podawany jest
eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie
4
w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia
wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w
aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii
preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi
parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC dzięki c zemu uzyskujemy rozdział
analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie,
przy mniejszym zużyciu eluenta i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej
chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczes nych aparatów i kolumn HPLC
są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.
W HPLC duże znaczenie dla rozdziału m a polarność faz. Początkowo stosowano normalny
układ faz (NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma
(Np. układ: żel krzemionkowy  heksan). Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ
faz (RP  układ faz odwróconych), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza
ruchoma, np. układ: żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią (grupy
oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej
złożone)  mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody, specjalnie dobranych buforów itp.
Podział zależy od wiązania się hydrofobowych cząsteczek substancji rozpuszczonej z fazy
ruchomej do unieruchomionych, hydrofobowych ligandów związanych z fazą stacjonarną.
Siła i charakter oddziaływania między cząsteczkami próbki i fazą stacjonarną zależy zarówno
od oddziaływań hydrofobowych jak i oddziaływań polarnych. Substancje rozpuszczone są
wymywane w kolejności rosnącej molekularnej hydrofobowości. Układy RP mają bardziej
trwałe wypełnienia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej a przede wszystkim cechują
się inną selektywnością niż układy NP co wykorzystuje się w analizie próbek o dużej
rozpiętości polarności komponentów.
75000
50000
25000
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
Rys.3. Przykładowy chromatogram barwników ogórka (metoda HPLC)
5
200000
150000
100000
50000
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min
Rys.3a. Przykładowy chromatogram barwników moreli (metoda HPLC)
75000
50000
25000
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
Rys.3b. Przykładowy chromatogram barwników cukinii o żółtej skórce (metoda HPLC)
75000
50000
25000
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0min
Rys.3c. Przykładowy chromatogram barwników cukinii o zielonej skórce (metoda HPLC)
2. Podstawa teoretyczna ćwiczeń  barwniki fotosyntetyczne
6
Karotenoidy
Są to związki organiczne (pochodne izoprenu), węglowodory nienasycone o długich 40 -sto
węglowych łańcuchach. W naturze mają zdolność do absorbowania światła widzialnego o
długości fali 440-480 nm, dlatego mają barwę od żółtej, przez pomarańczową do czerwon ej.
U roślin zlokalizowane są w chromoplartrach oraz w chloroplastach, gdzie pełnia odmienne
funkcje. Karotenoidy dzielimy na karoteny o barwie pomarańczowej i czerwonej oraz
ksantofile o barwie żółtej.
Znaczenie karotenoidów dla człowieka:
·ð WpÅ‚ywajÄ… na obniżenie poziomu cholesterolu we krwi, a co za tym idzie korzystnie
działa na serce.
·ð PomagajÄ… w zwiÄ™kszeniu odpornoÅ›ci naszego organizmu, chroniÄ…c nas w ten sposób
przed chorobami, dotyczy to zwłaszcza beta -karotenu, który stymuluje zwiększenie
liczby limfocytów, będących składnikami naszego układu immunologicznego.
·ð WykazujÄ… dziaÅ‚anie przeciwnowotworowe. Głównie dziÄ™ki temu, iż dziaÅ‚ajÄ… jako
"zmiatacze wolnych rodników" są więc świetnymi antyutleniaczemi.
·ð Betakakaroten ma szczególnie duże znaczenie w zapobieg aniu pewnym postaciom
raka skóry, pojawiającym się pod wpływem promieniowania UV lub substancji
chemicznych.
Znaczenie karotenoidów dla roślin:
·ð ZwiÄ…zki te peÅ‚niÄ… pomocniczÄ… rolÄ™ w procesie fotosyntezy, ponieważ absorbujÄ… pewne
zakresy promieniowania świetlnego (niebieska, fioletowa) aby następnie przekazywać
energiÄ™ stanu wzbudzonego na czÄ…steczkÄ™ chlorofilu.
·ð PeÅ‚niÄ… również funkcjÄ™ ochronnÄ… przed procesami fotooksydacji, na które narażone sÄ…
głównie nienasycone kwasy tłuszczowe lipidów chloroplastowych. W liściach, ich
barwa jest maskowana przez zieloną barwę barwników chlorofilowych, uwidocznia
siÄ™ to jesieniÄ…, kiedy chlorofile sÄ… degradowane przez enzymy: chlorofilazÄ™,
decheletazÄ™ i oksygenazÄ™
·ð PrzykÅ‚adem karotenoidu jest ²-karoten. Karotenoidy nadajÄ… rów nież barwÄ™ innym
częściom rośliny, np. korzeniowi marchwi czy owocom moreli
·ð Ponadto speÅ‚niajÄ… ważnÄ… rolÄ™ ochronnÄ… przed uszkodzeniem fotosystemu
spowodowanym nadmiarem docierającej energii świetlnej, pochłaniając ją i
7
powodując jej dyspersję (czyli rozpros zenie) albo też przekierowując na inne procesy
fizjologiczne w komórce.
Chlorofile
Chlorofile  to zielone barwniki charakterystyczne dla roślin, niektórych alg i bakterii,
które mają zdolność przeprowadzania procesu fotosyntezy (sinice ). Zielone zabarwienie
chlorofilu spowodowane jest wysoką absorpcją w czerwonej i niebieskiej części spektrum
światła, a niską absorpcją w zielonej części spektrum światła (długość fali 500 -600 nm).
Chlorofil zlokalizowany jest w chloroplastach i dzięki temu rośliny (głównie liściom, ale
też łodygi i niedojrzałe owoce mają zielone zabarwienie ). Funkcją chlorofili w
organizmach przeprowadzających fotosyntezę jest wychwytywanie kwantów światła i
przekazywanie energii wzbudzenia do centrum reakcji fotoukładu skąd wybijane są
elektrony, spożytkowane następnie w dalszych etapach fotosyntezy. Znaczna zawartość
chlorofili w organizmach fotosyntetyzujÄ…cych jest odpowiedzialna za ich zielonÄ… barwÄ™.
Wyróżnia się wiele rodzajów chlorofili. Najbardziej rozpowszechnione w przyrodzie to
chlorofil a i chlorofil b występujące u wszystkich roślin przeprowadzających fotosyntezę.
Znaczenie chlorofili dla człowieka
·ð Chlorofil nazywany jest  roÅ›linnÄ… krwiÄ… ponieważ jego czÄ…steczka ma budowÄ™
niemal identyczną z cząsteczką hemoglobiny. Jedyna różnic a to występowanie w
centralnej części hemoglobiny atomu żelaza, a w chlorofilu atomu magnezu.
·ð Zwalcza liczne bakterie patogenne i reguluje florÄ™ jelitowÄ…, co wpÅ‚ywa pozytywnie na
działanie jelit
·ð Zapobiega wzrostowi kamieni w nerkach . Zawarty w czÄ…stce chlorofilu magnez jest
antagonistÄ… wapnia i zapobiega powstawaniu szczawianu wapnia.
·ð Stabilizuje ciÅ›nienie krwi i oddychanie oraz wzmacnia miÄ™sieÅ„ sercowy
·ð Spowalnia proces utleniania siÄ™ komórek, wskutek czego zapobiega przedwczesnemu
starzeniu, jak i arteriosklerozie
·ð Ze wzglÄ™du na zdolność stabilizacji wzbudzonych elektronów eliminuje wolne
rodniki, które mogą uszkadzać komórki i chroni przed szkodliwym promieniowaniem
UV
·ð Ma zdolność chelatowania eliminuje toksyny i metale ciężkie z or ganizmu
8
Zagadnienia do przygotowania na kolokwium, z tematyki nr. 1
1. Czym jest chromatografia cieczowa
2. Zasada działania komory chromatograficznej TLC
3. Porównanie metod identyfikacji związków w chromatografii TLC i CC
4. Zastosowanie chromatografii HPLC w pra ktyce
5. Metody identyfikacji związków w chromatografii HPLC
6. Wady i zalety chromatografii kolumnowej (otwartej) i HPLC
7. Znaczenie karotenoidów dla roślin i człowieka
8. Znaczenie chlorofili dla roślin i człowieka
9. Budowa i działanie wybranych modułów urządzenia HP LC
9