plik

��PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie Marta Wanarska, J�zef Kur Katedra Mikrobiologii, Wydzia� Chemiczny, Politechnika Gda�ska, Gda�sk -D-galactosidases sources, properties and applications Summar y The rapid development of the world industry requires the introduction of new technologies which are more effective and cheaper. Therefore, the applica- tion of enzymes in different industry sectors grows steadily. This article reviews some properties and applications of -D-galactosidases derived from microbial sources. Key words: -D-galactosidase, lactose hydrolysis, transglycosylation. 1. Wst�p Rozw�j Swiatowego przemys�u uzale�niony jest od wprowa- dzania coraz nowszych technologii, kt�re umo�liwiaj� wydajn� i tani� produkcj� wysokiej jakoSci d�br konsumpcyjnych. Trady- cyjne technologie stosowane w przemySle cz�sto nie spe�niaj� tych wymog�w, wymagaj� du�ych nak�ad�w energii, charaktery- Adres do korespondencji zuj� si� zu�yciem du�ej iloSci substrat�w i wytworzeniem znacz- Marta Wanarska, nej iloSci odpad�w poprodukcyjnych. Z tych wzgl�d�w coraz Katedra Mikrobiologii, Wydzia� Chemiczny, cz�Sciej stosowane s� procesy technologiczne, w kt�rych rol� Politechnika Gda�ska, katalizator�w reakcji chemicznych pe�ni� enzymy. G��wn� w�aS- ul. Narutowicza 11/12, ciwoSci� enzym�w jest ich aktywnoS� katalityczna i specyficz- 80-952 Gda�sk. noS� dzia�ania. Reakcje katalizowane enzymatycznie przebiegaj� z du�� szybkoSci� w �agodnych warunkach i pozwalaj� na uzy- 4 (71) 46 62 2005 skanie po��danego produktu z du�� wydajnoSci�. Stosowanie -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie enzym�w umo�liwia te� uzyskanie jednego produktu b�d�cego okreSlonym izome- rem przestrzennym (stereoizomerem). Chocia� aktywnoS� katalityczna enzym�w od wiek�w by�a wykorzystywana przez cz�owieka, dopiero rozw�j nowoczesnej bio- technologii pozwoli� na szerokie zastosowanie tych biokatalizator�w w procesach przemys�owych. Na najwi�ksz� skal� produkowane s� i wykorzystywane enzymy hy- drolityczne: proteazy, lipazy i hydrolazy glikozydowe. Jako sk�adniki proszk�w do prania stosowane s� na co dzie� w ka�dym gospodarstwie domowym (1). Enzymy znajduj� te� coraz wi�ksze zastosowanie w przemySle farmaceutycznym. Lipazy, acylazy i glikozylotransferazy wykorzystywane s� w regio- i stereoselektywnej syn- tezie lek�w (2,3). Natomiast przemys� chemiczny stosuje kataliz� enzymatyczn� w produkcji akrylamidu, 1,3-propanodiolu, a tak�e zwi�zk�w chemicznych wyka- zuj�cych czynnoS� optyczn� (3). Obecnie wi�kszoS� enzym�w stosowanych w procesach przemys�owych pocho- dzi z mikroorganizm�w mezofilnych, jednak wzrastaj�ce zapotrzebowanie na bio- katalizatory sprawia, �e ci�gle poszukiwane s� nowe xr�d�a enzym�w o specyficz- nych w�aSciwoSciach. Przyk�adowo, enzymy b�d�ce sk�adnikami proszk�w do prania (proteazy, lipazy, amylazy i celulazy) musz� by� aktywne i stabilne w wysokim pH. W ostatnich latach wzros�o te� zainteresowanie enzymami wykazuj�cymi wysok� aktywnoS� w niskich temperaturach. Zastosowanie tych biokatalizator�w w Srod- kach pior�cych pozwoli�oby na zmniejszenie zu�ycia energii elektrycznej (1). Nato- miast -amylazy wykorzystywane w przetw�rstwie skrobi musz� wykazywa� aktyw- noS� i stabilnoS� w wysokiej temperaturze. Pierwszy etap przemys�owego procesu wytwarzania syrop�w skrobiowych, prowadzony jest w temperaturze 80-90�C, kt�- ra zapewnia odpowiedni� rozpuszczalnoS� substratu, zapobiega zanieczyszczeniom mikrobiologicznym bioreaktora i powoduje str�canie pozosta�oSci bia�ek zanieczysz- czaj�cych skrobi� (1,4). W przypadku -galaktozydaz wykorzystywanych w przemy- Sle mleczarskim do produkcji bezlaktozowego mleka, istniej� dwa alternatywne rozwi�zania pozwalaj�ce na ulepszenie dotychczas stosowanej technologii. Zasto- sowanie enzymu aktywnego w niskiej temperaturze umo�liwi�oby przeprowadzenie hydrolizy laktozy w warunkach ch�odniczych i zapobieg�o rozwojowi niepo��danej mikroflory podczas prowadzenia procesu. Natomiast wykorzystanie termostabilnej -D-galaktozydazy pozwoli�oby na jednoczesn� hydroliz� disacharydu i pasteryza- cj� mleka. 2. AktywnoSci enzymatyczne -D-galaktozydaz -D-galaktozydaza (EC 3.2.1.23) jest enzymem katalizuj�cym reakcj� hydrolizy wi�za� O-glikozydowych w -D-galaktozydach. Najbardziej znanym galaktozydem jest disacharyd wyst�puj�cy w mleku laktoza. Katalizowana enzymatycznie reak- cja hydrolizy wi�zania -1,4-glikozydowego w laktozie prowadzi do powstania cz�- steczek D-glukozy i D-galaktozy (I). Niekt�re -D-galaktozydazy wykazuj� r�wnie� BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 47 Marta Wanarska, J�zef Kur zdolnoS� syntezy wi�za� glikozydowych, kt�ra prowadzi do powstania �a�cucha oli- gosacharydowego, gdy substratem reakcji jest laktoza (II). -D-galaktozydaza laktoza D-glukoza + D-galaktoza (I) -D-galaktozydaza laktoza mieszanina galaktooligosacharyd�w (II) Obie aktywnoSci -D-galaktozydazy hydrolityczna i transferazowa s� ze sob� nierozerwalnie zwi�zane, a ich mechanizm jest wsp�lny. Obejmuje on trzy nast�- puj�ce po sobie etapy, a ostatni z nich decyduje, czy zachodzi reakcja hydrolizy czy transglikozylacji: enzym + laktoza enzym-laktoza (I), enzym-laktoza galaktozyl-enzym + glukoza (II), galaktozyl-enzym + akceptor galaktozyl-akceptor + enzym (III). W pierwszym etapie nast�puje wi�zanie cz�steczki laktozy w centrum aktywnym -D-galaktozydazy. Drugi etap obejmuje rozszczepienie disacharydu z udzia�em reszt aminokwasowych enzymu o znaczeniu katalitycznym. Cz�steczka glukozy opuszcza wn�k� katalityczn�, zaS reszta galaktozylowa pozostaje zwi�zana z enzymem. W os- tatnim etapie nast�puje przeniesienie reszty galaktozylowej na cz�steczk� akcepto- ra i produkt reakcji opuszcza centrum aktywne -D-galaktozydazy. Je�eli akcepto- rem jest woda, uwolniona zostaje cz�steczka D-galaktozy. Je�eli zaS rol� akceptora pe�ni cz�steczka cukru (laktoza lub jeden z produkt�w jej hydrolizy), powstaje ga- laktooligosacharyd (5). Reakcj� preferowan� przez -D-galaktozydazy jest na og�� reakcja hydrolizy. W celu zwi�kszenia efektywnoSci reakcji transglikozylacji nale�y zwi�kszy� st��enie akceptora lub zastosowa� niskowodne Srodowisko reakcji. Wy- kazano, �e akceptorem w reakcji transglikozylacji mo�e by� nie tylko cz�steczka cu- kru, ale r�wnie� alkoholu (6), antybiotyku (7) lub pochodna aminokwasu (8). Dzi�ki temu -D-galaktozydazy mog� znalex� zastosowanie przy produkcji farmaceutyk�w i innych zwi�zk�w biologicznie czynnych. 3. Charakterystyka -D-galaktozydaz z r��nych xr�de� -D-galaktozydaza jest enzymem syntetyzowanym przez kom�rki ssak�w, roS- lin, dro�d�y, grzyb�w strz�pkowych i bakterii. W zale�noSci od xr�d�a pochodze- nia, enzymy r��ni� si� mas� cz�steczkow�, liczb� podjednostek wchodz�cych 48 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie w sk�ad natywnej cz�steczki, wartoSciami optymalnej temperatury i pH dzia�ania, a tak�e zapotrzebowaniem na jony metali niezb�dne dla aktywnoSci enzymu lub/i stabilizacji jego struktury. -D-galaktozydazy r��ni� si� r�wnie� spektrum substra- towym, wra�liwoSci� na dzia�anie inhibitor�w i aktywator�w oraz termostabilno- Sci�. Najbogatszym xr�d�em -D-galaktozydaz o r��nych w�aSciwoSciach s� mikro- organizmy. Niekt�re z nich zdolne s� do syntezy kilku r��nych -D-galaktozydaz, np. Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 wytwarza dwa enzymy (9), zaS z Bacillus circulans wyizolowano a� trzy r��ne -D-galaktozydazy (10). -D-galaktozydazy s� najcz�Sciej bia�kami oligomerycznymi. Jednym z wyj�tk�w s� enzymy syntetyzowane przez grzyby z rodzaju Aspergillus, kt�re wyst�puj� w po- staci monomeru. A. niger wytwarza trzy r��ne formy glikoproteiny o aktywnoSci -D-galaktozydazy, r��ni�ce si� liczb� reszt cukrowych (11). Enzymy z A. aculeatus i A. oryzae s� r�wnie� monomerami (12-14). -D-galaktozydazy z dro�d�y K. fragilis i K. lactis s� homodimerami (15,16). Dwie identyczne podjednostki ma te� enzym z psychrofilnej antarktycznej cyjanobakterii z rodzaju Planococcus (17). Wiele -D-ga- laktozydaz ma posta� tetrameru. Z czterech identycznych podjednostek sk�adaj� si�: -D-galaktozydaza LacZ z E. coli (18), enzymy pochodz�ce z antarktycznych bakterii Arthrobacter (19) i Pseudoalteromonas sp. 22b (20), -D-galaktozydaza z Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 ( -gal II) (9), czy enzym z Penicillium chrysogenum (21). r�d�o, z kt�rego wyizolowano -D-galaktozydaz� decyduje najcz�Sciej o opty- malnych wartoSciach temperatury, pH oraz st��enia soli wymaganych do prowadze- nia przez dany enzym efektywnej katalizy. Bywa jednak, �e z organizmu mezofilne- go mo�na wyizolowa� enzym, kt�rego optymalna temperatura dzia�ania b�dzie wy- nosi�a nawet 85�C (22). R��nice w optymalnych wartoSciach temperatury i pH dla swojego dzia�ania mog� wykazywa� te� -D-galaktozydazy pochodz�ce z jednego organizmu. Trzy enzymy wyizolowane z Bacillus circulans s� tego doskona�ym przyk�adem. -D-galaktozydaza-I wykazuje najwy�sz� aktywnoS� w 44�C i w buforze o pH 6,0, optymalne warunki dzia�ania dla -D-galaktozydazy-II to pH 4,0 i 74�C, zaS dla -D-galaktozydazy-III pH 4,0 i 60�C (10). Wykorzystywane w przemySle mle- czarskim enzymy z dro�d�y s� aktywne w Srodowisku oboj�tnym i lekko kwaSnym (pH 6,0-7,0), zaS -D-galaktozydazy otrzymywane z grzyb�w strz�pkowych wyka- zuj� najwy�sz� aktywnoS� w pH 3,5-4,5 (23). Ciekawym enzymem jest -D-galakto- zydaza z halofilnego archaeona Haloferax alicantei, kt�ra maksymaln� aktywnoS� wy- kazuje w buforze zawieraj�cym 4 M NaCl (24). Z definicji -D-galaktozydazy wynika, �e podstawowym substratem enzymu jest laktoza. Jednak niekt�re -D-galaktozydazy nie rozk�adaj� tego disacharydu. Dzieje si� tak w przypadku jednego z enzym�w wyizolowanych z Bifidobacterium adolescentis DSM 20083, kt�ry hydrolizuje wi�zania glikozydowe w oligosacharydach powsta�ych z laktozy na drodze transglikozylacji, a nie wykazuje aktywnoSci hydrolitycznej w sto- sunku do laktozy (9). W przeprowadzonych badaniach ujawniono, �e r�wnie� -D-ga- laktozydaza z Haloferax alicantei nie hydrolizuje laktozy, wykazuje zaS zdolnoS� hydro- lizy wi�za� -1,4-glikozydowych laktulozy (O- -D-galaktopiranozylo-(1 4)-D-frukto- BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 49 Marta Wanarska, J�zef Kur piranoza) (24). Niekt�re -D-galaktozydazy maj� bardzo ograniczone spektrum sub- stratowe i wykazuj� aktywnoS� tylko w stosunku do -D-galaktozyd�w (19,20,25). Inne zaS s� ma�o specyficzne i hydrolizuj� zar�wno -D-galaktozydy, jak i -D-glukozy- dy, np. enzymy z Sulfolobus solfataricus i Pyrococcus furiosus (26-28). Ze wzgl�du na sze- rokie spektrum substratowe, enzymy te cz�sto nazywane s� -glikozydazami. Enzym wyizolowany z Rhodotorula minuta IFO897 wykazuje aktywnoS� hydrolityczn� w sto- sunku do -D-galaktozyd�w, -D-glukozyd�w, -D-fukozyd�w i -L-arabinozyd�w (29). Jony metali nie tylko stabilizuj� struktur� enzym�w, ale mog� te� wp�ywa� na ich aktywnoS�, dzia�aj�c aktywuj�co lub pe�ni�c rol� inhibitora. AktywnoS� -D-ga- laktozydaz zazwyczaj wzrasta, gdy w buforze znajduj� si� jony Na+, K+ i Mg2+. Jony metali ci��kich dzia�aj� zaS jako inhibitory (23,26). Kationy Ca2+ r�wnie� ob- ni�aj� aktywnoS� wielu -D-galaktozydaz (16,23,26,30). Silnym aktywatorem enzy- mu z dro�d�y K. lactis i K. fragilis jest Mn2+. Jony Co2+ tak�e stymuluj� aktywnoS� -D-galaktozydazy z K. fragilis (15,16). W przypadku -D-galaktozydazy z Mucor pusillus, �aden z testowanych jon�w (Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) nie mia� wp�ywu na aktywnoS� enzymu (31). W celu okreSlenia, czy enzym nie wymaga obec- noSci jon�w dwuwartoSciowych dla maksymalnej aktywnoSci, cz�sto stosuje si� kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). R�wnie� zwi�zki zawieraj�ce grupy tiolo- we maj� wp�yw na aktywnoS� -D-galaktozydaz. W badaniach wykazano, �e enzym z Pseudoalteromonas sp. 22b jest silnie aktywowany przez ditiotreitol (20), zaS na ak- tywnoS� -galaktozydazy z Mucor pusillus nie wp�ywaj� ani zwi�zki maj�ce grupy tio- lowe, ani EDTA (31). Stwierdzono r�wnie�, �e wsp�lna obecnoS� Mg2+ i 2-merkap- toetanolu w mieszaninie reakcyjnej silnie aktywuje enzym z dro�d�y K. lactis. Sam 2-merkaptoetanol nie mia� wp�ywu na aktywnoS� -D-galaktozydazy, zaS dodatek samego Mg2+ s�abo j� aktywowa�. Mo�liwe jest, �e zwi�zki te tworz� kompleks i dopiero on aktywuje -D-galaktozydaz� z K. lactis (16). Podobnie jak wp�yw jon�w, tak i wp�yw cukr�w na aktywnoS� -D-galaktozydaz jest cech� specyficzn� dla ka�dego z tych enzym�w. Intensywnie badany jest przede wszystkim wp�yw glukozy i galaktozy na przebieg reakcji hydrolizy laktozy. Stwier- dzono, �e 10 mM st��enie glukozy lub galaktozy powoduje zmniejszenie aktywno- Sci -D-galaktozydazy z Thermus 4-1A odpowiednio o 46 i 30% (32). Niekiedy tylko jeden z produkt�w hydrolizy laktozy wywiera dominuj�ce oddzia�ywanie na aktyw- noS� enzymu, np. w przypadku -D-galaktozydazy z Mucor pusillus, roztw�r galakto- zy o st��eniu 10 mM powoduje spadek aktywnoSci enzymu o 77,4%, a glukoza w tym samym st��eniu nie wp�ywa na jego aktywnoS� (31). Glukoza jest natomiast inhibitorem -D-galaktozydazy z Rhodotorula minuta IFO879 (29). Charakterystyk� -D-galaktozydaz pochodz�cych z r��nych xr�de� przedstawio- no w tabeli. 50 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie 4. Charakterystyka termostabilnych -D-galaktozydaz Od oko�o 30 lat trwaj� prace nad izolacj� i charakterystyk� enzym�w pocho- dz�cych z organizm�w termofilnych. W 1972 r. zosta�a opisana termostabilna -D-galaktozydaza wyizolowana z kom�rek termofilnej bakterii Thermus sp. T2. Mi- kroorganizm pochodzi� z gor�cego xr�d�a w Parku Narodowym Yellowstone w USA i by� podobny morfologicznie do Thermus aquaticus. Du�a iloS� enzymu o aktywnoSci -D-galaktozydazy wytwarzana by�a w kom�rkach Thermus sp. T2 podczas ich ho- dowli w po�ywce zawieraj�cej galaktoz�. Wyizolowany z tych kom�rek enzym mia� mas� cz�steczkow� 570 kDa (33). -D-galaktozydaza Thermus sp. T2 jest kodowana przez gen bgaA. Polipeptyd b�d�cy produktem ekspresji tego genu sk�ada si� z 645 reszt aminokwasowych. Obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej jego masa cz�steczkowa wynosi 73,595 kDa (34), co sugeruje, �e enzym w formie natyw- nej jest oktamerem. Optymalne warunki dzia�ania enzymu to 80�C i pH 5,0. Maksy- maln� aktywnoS� termostabilna -D-galaktozydaza wykazuje jedynie w obecnoSci jon�w Na+. Jony Mn2+ i Fe2+ s� aktywatorami enzymu, zaS dodatek kation�w Mg2+ i Co2+ nie wp�ywa na jego aktywnoS� (33). W innych badaniach wykazano nato- miast, �e jony Mn2+, Co2+ i Cu2+ s� inhibitorami tej -D-galaktozydazy (15). Obec- noS� cysteiny i 2-merkaptoetanolu w mieszaninie reakcyjnej powoduje zwi�kszenie aktywnoSci tej -D-galaktozydazy. Dodatek cysteiny wp�ywa ponadto na zwi�ksze- nie jej termostabilnoSci (33). Termostabiln� -D-galaktozydaz� wyizolowano r�wnie� z kom�rek bakterii Thermus sp. 4-1A (szczep izolowany w Nowej Zelandii). Podobnie jak w przypadku Thermus sp. T2, ekspresja genu koduj�cego enzym zachodzi�a najefektywniej po do- daniu do po�ywki galaktozy. Masa cz�steczkowa enzymu wynosi�a 440 kDa. Wszyst- kie oznaczenia aktywnoSci enzymu w reakcji z ONPG (o-nitrofenylo- -D-galaktopira- nozyd) wykonywano w 70�C i pH 6,0. Wykazano, �e zwi�zki zawieraj�ce grupy tiolo- we (cysteina, 2-merkaptoetanol, czy ditiotreitol) s� aktywatorami enzymu z Thermus sp. 4-1A, zaS kwas jodooctowy (inhibitor enzym�w zawieraj�cych w centrum aktyw- nym reszty cysteiny) ca�kowicie go inaktywuje. Silny wzrost aktywnoSci -D-galakto- zydazy powoduje dodatek EDTA do mieszaniny reakcyjnej. Natomiast jony Zn2+, Cu2+, Cu+, Fe2+, Fe3+, Ni2+ i Mn2+ s� inhibitorami enzymu. S�aby wzrost aktywnoSci zanotowano tylko w obecnoSci jon�w Mg2+, zaS kationy Ca2+ i Co2+ nie wp�ywa�y na aktywnoS� termostabilnej -D-galaktozydazy. W badaniach nad wp�ywem cu- kr�w na aktywnoS� enzymu wykazano, �e 10 mM st��enie laktozy, glukozy i galak- tozy w mieszaninie reakcyjnej powoduje obni�enie aktywnoSci enzymu odpowied- nio o 22, 46 i 30%. -D-galaktozydaza ze szczepu Thermus 4-1A jest wysoce termo- stabilnym enzymem. Po 20 godzinach inkubacji w 80�C zachowuje 83% pocz�tkowej aktywnoSci. Dodanie 0,5% NaCl zwi�ksza termostabilnoS� enzymu (32). Scharakteryzowano r�wnie� enzym wyizolowany z kom�rek termofilnych bakte- rii Thermus sp. A4 (szczep wyizolowany z gor�cych xr�de� Atagawa w Japonii). Stwierdzono, �e natywna cz�steczka enzymu jest monomerem. Na podstawie se- BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 51 Marta Wanarska, J�zef Kur kwencji nukleotydowej genu ustalono, �e bia�ko zbudowane jest z 645 reszt amino- kwasowych, a jego masa cz�steczkowa wynosi 72,741 kDa i jest mniejsza od wyzna- czonej dla tego bia�ka z zastosowaniem techniki SDS-PAGE (75 kDa) i filtracji �elo- wej (86 kDa). Za optymalne warunki aktywnoSci enzymu uznano pH 6,5 i temperatu- r� 70�C. W tej temperaturze enzym jest ca�kowicie stabilny i nawet po 20 godzinach inkubacji zachowuje pe�n� aktywnoS�. Aktywatorami -D-galaktozydazy z Thermus sp. A4 s� zwi�zki zawieraj�ce grupy SH (ditiotreitol, cysteina i 2-merkaptoetanol), jony Co2+, Mn2+ i Zn2+ oraz, w mniejszym stopniu, EDTA. Spadek aktywnoSci enzy- mu powoduj� zaS jony Cu2+ i Fe2+. ObecnoS� kation�w Mg2+ w mieszaninie reak- cyjnej nie ma wp�ywu na aktywnoS� tej -D-galaktozydazy. Nie zanotowano te� in- aktywacji enzymu pod wp�ywem kwasu jodooctowego. Podobnie jak w przypadku -D-galaktozydazy z Thermus 4-1A, 10 mM st��enie laktozy, glukozy i galaktozy w mieszaninie reakcyjnej powoduje obni�enie aktywnoSci enzymu. Najsilniejszym inhibitorem jest galaktoza. W jej obecnoSci aktywnoS� enzymu jest o 40% ni�sza od poziomu uzyskanego dla pr�by kontrolnej nie zawieraj�cej cukru. Termostabilna -D-galaktozydaza z Thermus sp. A4 nie wykazywa�a aktywnoSci transglikozylacyjnej w warunkach, w kt�rych prowadzono badania (35). Ciekawe wyniki dotycz�ce struk- tury -D-galaktozydazy z Thermus sp. A4 uzyskano na podstawie analizy kryszta��w enzymu. We wczeSniejszych badaniach ustalono, �e enzym wyizolowany z kom�rek Thermus sp. A4 wyst�puje w postaci monomeru (filtracja �elowa, SDS-PAGE) (35). To samo bia�ko wyizolowane z kom�rek rekombinowanego szczepu E. coli charaktery- zowa�o si� mas� cz�steczkow� 170 kDa, co sugerowa�o, �e jest oligomerem zbudo- wanym z 2 lub 3 podjednostek. Na podstawie analizy kryszta��w enzymu jedno- znacznie potwierdzono, �e jest on homotrimerem. R��nice w stopniu oligomeryza- cji -D-galaktozydazy s� najprawdopodobniej wynikiem zastosowania r��nych pro- cedur oczyszczania bia�ka (36). Termostabiln� -D-galaktozydaz� wykazuj�c� aktywnoS� transglikozylacyjn� wy- izolowano z kom�rek Thermus aquaticus YT-I. Enzym ten b�d�cy oligomerem ma nie- zwykle du�� mas� cz�steczkow�, przekraczaj�c� 700 kDa. Masa cz�steczkowa jed- nej podjednostki wynosi 59 kDa. Optymalne warunki dzia�ania -D-galaktozydazy to pH 5,5 i 80�C. Enzym zachowuje ponad 80% aktywnoSci w zakresie temperatur 65-85�C. Powy�ej 85�C aktywnoS� enzymu gwa�townie spada na skutek denaturacji termicznej, ale obecnoS� CaCl2 powoduje zwi�kszenie jego termostabilnoSci. Jony Ca2+ s� najsilniejszymi aktywatorami -D-galaktozydazy z T. aquaticus YT-I. Zwi�k- szenie aktywnoSci enzymu powoduj� r�wnie� kationy Fe3+, Zn2+, Co2+, Mg2+ oraz jony Na+, Li+ i K+. W obecnoSci kation�w Mn2+ nie zanotowano zmian aktywnoSci enzymu, zaS jony Fe2+, Cu2+ i Ni2+ j� obni�a�y. Aktywatorami -D-galaktozydazy s� zwi�zki maj�ce grupy tiolowe, zaS kwas jodooctowy i inne inhibitory enzym�w za- wieraj�cych w centrum aktywnym reszty cysteiny, powoduj� inaktywacj� enzymu. -D-galaktozydaza katalizuje reakcj� hydrolizy wi�za� glikozydowych w -D-galak- tozydach i -D-glukozydach, wykazuje jednak wi�ksze powinowactwo do o-nitrofe- nylo- -D-galaktopiranozydu i p-nitrofenylo- -D-galaktopiranozydu ni� do p-nitrofe- 52 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie nylo- -D-glukopiranozydu. Produkty hydrolizy laktozy s� inhibitorami tej -D-galak- tozydazy. Glukoza powoduje silniejszy efekt inhibicji ni� galaktoza. Enzym wykazu- je ponadto aktywnoS� transglikozylacyjn�. G��wnymi produktami reakcji transgliko- zylacji, kt�rej substratem jest laktoza, s� tri- i tetrasacharydy (37). r�d�em termostabilnej -D-galaktozydazy mog� by� te� termofilne grzyby Rhizomucor sp., bakterie Bacillus coagulans RCS3 lub mezofilne dro�d�e Sterigmatomyces elviae CBS8119. Termofilne grzyby strz�pkowe Rhizomucor sp. produkuj� zewn�trzkom�rkow� -D-galaktozydaz� o masie cz�steczkowej 250 kDa. Enzym jest glikoprotein� i wy- st�puje w postaci dimeru. Masa cz�steczkowa jednej podjednostki wynosi 120 kDa. Optymalne warunki dzia�ania tej -galaktozydazy to pH 4,5 i temperatura 60�C. W tej temperaturze enzym zachowuje stabilnoS� przez 4 godziny, zaS w temperatu- rze 70�C jego czas p��trwania wynosi 150 minut. -D-galaktozydaza z Rhizomucor sp. wykazuje wysok� specyficznoS� substratow�. Hydrolizuje tylko wi�zania glikozy- dowe w -D-galaktozydach. ObecnoS� jon�w K+, Na+ oraz Mg2+ i innych kation�w dwuwartoSciowych w mieszaninie reakcyjnej nie ma wp�ywu na aktywnoS� enzymu. Po wykonaniu intensywnej dializy wobec buforu zawieraj�cego EDTA potwierdzo- no, �e -D-galaktozydaza z Rhizomucor sp. nie wymaga jon�w metali do zachowania pe�nej aktywnoSci. Kationy Hg2+ i Cu2+ oraz galaktoza i IPTG (izopropylo- -D-tioga- laktopiranozyd) s� inhibitorami enzymu (38). Zewn�trzkom�rkowa termostabilna -D-galaktozydaza jest produkowana przez termofilny szczep Bacillus coagulans RCS3. Maksymaln� aktywnoS� enzym wykazuje w temperaturze 65�C i pH 6,8. Pozostaje ona na wysokim poziomie w pH 6,0-7,0 i temperaturze 63-67�C. Za optymaln� temperatur� dzia�ania enzymu przyj�to 63�C, bo w tych warunkach -D-galaktozydaza wykazuje wysok� stabilnoS� termiczn� (czas p��trwania enzymu wynosi 15 godzin). Silnymi inhibitorami enzymu s� jony Cu2+, Hg2+ i Ni2+ oraz galaktoza. Kationy Mn2+ powoduj� s�ab� aktywacj�, podob- nie jak wysokie st��enie EDTA (20 mM) (39). Termostabilna -D-galaktozydaza syntetyzowana w kom�rkach Sterigmatomyces elviae CBS8119 zwi�zana jest ze Scian� kom�rkow� mikroorganizmu. Po enzyma- tycznej lizie kom�rek dro�d�y, enzym izolowano, z frakcji zawieraj�cej nierozpusz- czalne ich fragmenty, g��wnie Sciany kom�rkowe. Masa cz�steczkowa -D-galakto- zydazy z S. elviae wynosi 170 kDa. W formie natywnej enzym jest dimerem z�o�o- nym z podjednostek o masie cz�steczkowej 86 kDa. Optymalne pH dzia�ania -D-ga- laktozydazy obejmuje zakres 4,5-5,0. Najwy�sz� aktywnoS� enzym uzyskuje w 85�C w pH 5,0. Wykazano, �e -D-galaktozydaza z S. elviae jest wysoce termostabilnym enzymem. Po 60-minutowej inkubacji w 80 i 85�C zachowuje odpowiednio 90 i 62% pocz�tkowej aktywnoSci. Inhibitorami enzymu s� jony Hg2+ i Pb2+. W przypadku in- nych dwuwartoSciowych kation�w metali, EDTA, kwasu jodooctowego, czy ditiotre- itolu nie stwierdzono wp�ywu na aktywnoS� enzymu. -D-galaktozydaza z S. elviae wy- kazuje ma�� specyficznoS� substratow�. Katalizuje reakcj� hydrolizy nie tylko -D-ga- laktozyd�w, ale r�wnie� -D-glukozyd�w, -D-fukozyd�w i -L-arabinozyd�w. BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 53 Tabel a Charakterystyka -galaktozydaz pochodz�cych z r��nych xr�de� r�d�o -D-galaktozydazy Mikroorganizmy Mikroorganizmy mezofilne psychrofilne 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B B B B B B B D D GS GS GS Bifidobacterium Aspergillus Arthrobacter Pseudoalteromonas Escherichia Bacillus Kluyveromyces Kluyveromyces Aspergillus Aspergillus Planococcus Leuconostoc* adolescentis oryzae sp. SB sp. 22b coli circulans lactis Y1140 fragilis niger aculeatus DSM 20083 RT102 Masa cz�steczkowa (kDa) 463 490 155 465 nb 212 350 270a 200 124b* 105 120b 145 150b* 86 173b* Liczba monomer�w 4 4 2 4 nb 1 4 2 2 1 1 1 Optymalna temp. dzia�ania 15 40 42 55 43 44 35 nbe 40f 30 46 55 (�C) 74 37 20c 58 60 60 60 Optymalne pH dzia�ania 7,0 6,0 6,5 6,0 7,2 6,0 6,0 6,9 6,5 2,5 4,5 5,4 4,0 8,0 8,0 7,5 4,0 7,3 6,8 4,0 AktywnoS� transglikozylacyjna nb nb nb + nb + nb + + nb nb + Literatura 19 20 17 18 30 10 916 15 11 13 12 25 25 57 54 14 48 56 52 54 Marta Wanarska, J�zef Kur PRACE PRZEGL�DOWE Tabel a c d. Charakterystyka -galaktozydaz pochodz�cych z r��nych xr�de� r�d�o -D-galaktozydazy Mikroorganizmy termofilne 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 GS GS B D D GS B B B B B B B Rhodotorula Bacillus Thermus Sulfolobus Mucor Penicillium Haloferax Sterigmatomyces Rhizomucor Thermus sp. Thermus sp. Thermus sp. Pyrococcus minuta coagulans aquaticus solfataricus pusillus chrysogenum alicantei elviae CBS8119 sp. T2 4-1A A4 woesei IFO879 RCS3 YT-I MT-4 Masa cz�steczkowa (kDa) 131b 270 180 144b 170 250b nb 570 440 86# >700 240 60# 170# 122# Liczba monomer�w 1 4 2 2 2 2 nb 8 nb 1# 12 4 1# 3# 2# Optymalna temp. dzia�ania 65 30 nbd 70 85 60 63 80 nbe* 70 80 95 92 (�C) 67c* 93 Optymalne pH dzia�ania 4,0 4,0 nbd 4, 4,5 4,5 6,0 5,0 6,0 6,5 5,5 6,5 5,4 5,0 5,2 5,0 7,0c* AktywnoS� transglikozylacyjna nb nb nb + + nb nb + nb + + + Literatura 31 21 24 29 22 38 39 15 32 35 37 27 45 53 33 36 40 47 34 43 ObjaSnienia skr�t�w: a wartoS� obliczona (2 � 135 kDa); B bakterie; b glikoproteina; b* trzy formy glikoproteiny r��ni�ce si� zawartoSci� cukr�w; c maksymaln� aktywnoS� enzymu zanotowano w 18�C, w pH 7,0; c* maksymaln� aktywnoS� enzymu zanotowano w 65�C, w pH 6,8; D dro�d�e; d pomiary aktywnoSci enzymu prowadzono w temperaturze pokojowej, w pH 7,2; e pomiary aktywnoSci enzymu prowadzono w 30�C; e* pomiary aktywnoSci enzymu prowadzono w 70�C; f temperatura, w kt�rej enzym wykazuje wysok� aktywnoS� i stabilnoS�, jednak maksymaln� aktywnoS� enzymu zanotowano w 50�C i pH 6,5; GS grzyby strz�pkowe; nb nie badano; * badano 6 szczep�w (Leuconostoc mesenteroides # subsp. mesenteroides 19D, 6M, 18F i 19M; Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 195; Leuconostoc lactis S3); wyniki uzyskane przez r��nych badaczy. BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie 55 Marta Wanarska, J�zef Kur Enzym ma te� wysok� aktywnoS� transglikozylacyjn�. WydajnoS� reakcji trans- glikozylacji prowadzonej przez 24 godziny w 60�C i pH 5,0 wynosi 39%. G��wnymi produktami s� tri- i tetrasacharydy oraz niewielka iloS� oligosacharyd�w o wy�szym stopniu polimeryzacji (22). Enzym o aktywnoSci -D-galaktozydazy wyizolowano r�wnie� z kom�rek hiper- termofilnego archaeona Sulfolobus solfataricus. Masa cz�steczkowa tej -D-galaktozy- dazy wynosi 240 kDa. W formie natywnej enzym jest tetrametrem z�o�onym z pod- jednostek o masie 60 kDa. Najwy�sz� aktywnoS� w reakcji z ONPG wykazuje w tem- peraturze 95�C i pH 6,5. -D-galaktozydaza z S. solfataricus nie wymaga obecnoSci dwuwartoSciowych jon�w metali do zachowania wysokiej aktywnoSci. Zwi�zki za- wieraj�ce grupy sulfhydrylowe powoduj� s�ab� aktywacj� enzymu. Natomiast obec- noS� pCMB (inhibitora enzym�w zawieraj�cych w centrum aktywnym reszty cysteiny) nie powoduje inaktywacji -D-galaktozydazy. D-galaktoza nie zmienia aktywnoSci enzymu w reakcji hydrolizy ONPG (40), jest natomiast s�abym inhibitorem w reakcji hydrolizy laktozy (41). W badaniach nad wp�ywem D-glukozy na aktywnoS� hydroli- tyczn� termostabilnej -D-galaktozydazy, prowadzonych przez dwa niezale�ne ze- spo�y badawcze wykazano, �e jest ona s�abym inhibitorem (40) lub te� aktywatorem enzymu (41). -D-galaktozydaza z S. solfataricus wykazuje niezwyk�� termostabilnoS�. Jej czas p��trwania w 75, 80 i 85�C wynosi odpowiednio 24, 10 i 3 godziny (40). En- zym charakteryzuje si� szerokim spektrum substratowym. Katalizuje reakcj� hydroli- zy wi�za� glikozydowych w syntetycznych -D-galaktozydach, -D-glukozydach i -D-fukozydach. Wykazuje r�wnie� aktywnoS� hydrolityczn� w stosunku do lakto- zy, celobiozy (O- -D-glukopiranozylo-(1 4)-D-glukopiranoza) i oligomer�w glukozy o stopniu polimeryzacji 3 i 4 (aktywnoS� egzoglukozydazy) (27). Szerokim spektrum substratowym charakteryzuje si� r�wnie� termostabilny enzym z archaeona Pyrococcus furiosus. Wykazuje on jednak wy�sz� aktywnoS� hydrolityczn� w stosunku do -D-glu- kozyd�w syntetycznych i naturalnych (p-nitrofenylo- -D-glukopiranozyd, celobioza), ni� -D-galaktozyd�w (p-nitrofenylo- -D-galaktopiranozyd, laktoza). Z tego wzgl�du enzym ten zosta� zakwalifikowany do -D-glukozydaz (28). Mimo to prowadzono badania nad wykorzystaniem obu hydrolaz glikozydowych ( -D-galaktozydazy z S. solfataricus i -D-glukozydazy z P. furiosus) zar�wno do hydrolizy laktozy, jak i syntezy oligosacharyd�w z laktozy w wysokiej temperaturze (41,42). Geny koduj�ce termostabilne enzymy z Thermus sp. T2, S. solfataricus, czy P. furiosus klonowano w kom�rkach E. coli. Prowadzono r�wnie� wydajn� biosyntez� termosta- bilnych enzym�w w kom�rkach mezofilnego gospodarza i wykazano, �e rekombino- wane bia�ka maj� zbli�one w�aSciwoSci do enzym�w wyizolowanych z naturalnego xr�d�a (34,41,43,44). W Katedrze Mikrobiologii Politechniki Gda�skiej skonstruowano szereg uk�ad�w ekspresyjnych pozwalaj�cych na wydajn� biosyntez� termostabilnej -D-galaktozyda- zy z hipertermofilnego archaeona Pyrococcus woesei (DSM 3773) w kom�rkach E. coli i Pichia pastoris (45-47). Gen koduj�cy termostabilne bia�ko zosta� zidentyfikowany i zsekwencjonowany. Na podstawie sekwencji nukleotydowej genu ustalono se- 56 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie kwencj� aminokwasow� kodowanego polipeptydu. Obliczona masa cz�steczkowa jednej podjednostki enzymu wynosi 59,056 kDa. -D-galaktozydaza zosta�a oczysz- czona i scharakteryzowana. Wyznaczona metod� filtracji �elowej masa cz�steczko- wa bia�ka wynosi 60 kDa (46) lub 122 kDa (47). Najwy�sz� aktywnoS� hydrolityczn� enzym wykazuje w pH 5,4 i 92-93�C (45-47). Enzym ma te� aktywnoS� transglikozy- lacyjn�. Jego aktywatorami s� zwi�zki zawieraj�ce grupy tiolowe, jony Mg2+ i D-ga- laktoza, a inhibitorami jony metali ci��kich i D-glukoza. Natomiast obecnoS� katio- n�w Ca2+ w mieszaninie reakcyjnej nie ma wp�ywu na aktywnoS� tej -D-galaktozy- dazy. Enzym nie wymaga obecnoSci dwuwartoSciowych jon�w metali do zachowa- nia wysokiej aktywnoSci. Po dializie wobec buforu zawieraj�cego EDTA nie stwier- dzono obni�enia jego aktywnoSci (47). Charakterystyk� termostabilnych -D-galaktozydaz zaprezentowano w tabeli. 5. Zastosowanie -D-galaktozydaz -D-galaktozydaz�, enzym katalizuj�cy reakcj� hydrolizy laktozy, wykorzystuje si� g��wnie w procesach produkcji mleka o niskiej zawartoSci laktozy, przeznaczo- nego dla os�b cierpi�cych z powodu nietolerancji tego disacharydu. Mleko o obni- �onej zawartoSci laktozy produkowane jest na skal� przemys�ow� w wielu krajach, z zastosowaniem r��nych technologii. W Kanadzie produkcja mleka bezlaktozowe- go polega na aseptycznym dodawaniu preparatu -D-galaktozydazy do mleka UHT po sterylizacji, w czasie nape�niania karton�w. Nast�pnie mleko poddaje si� kilku- dniowej inkubacji. Inn� metod� stosuje si� w Japonii. Mleko szczepi si� kultur� Lactobacillus, inkubuje przez 4 godziny, a nast�pnie poddaje sonifikacji. Inkubacj� kontynuuje si� przez nast�pne 12 godzin, co prowadzi do uzyskania 71-74% stopnia redukcji laktozy. W USA, opr�cz przemys�owo produkowanego mleka bezlaktozo- wego, dost�pne s� preparaty enzymatyczne s�u��ce do domowej hydrolizy laktozy. Do mleka dodaje si� 5-15 kropli preparatu i inkubuje przez 24 godziny (58). W wielu krajach dost�pne s� r�wnie� tabletki zawieraj�ce -D-galaktozydaz�, kt�re nale�y przyjmowa� przed wypiciem mleka. W Polsce mleko o obni�onej zawartoSci laktozy produkowane jest przez SM Ma�kowy w Gda�sku. Mleko ze zhydrolizowan� laktoz� wykorzystywane jest do produkcji jogurt�w. W technologii wytwarzania jogurtu stosowane s� tzw. szczepionki jogurtowe, za- wieraj�ce szczepy bakterii Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Mikro- organizmy te maj� zdolnoS� fermentacji laktozy. Zastosowanie mleka poddanego wczeSniej dzia�aniu -D-galaktozydazy, w celu roz�o�enia laktozy na cukry proste (D-glukoz� i D-galaktoz�), stymuluje rozw�j tych bakterii, co pozwala na znaczne skr�cenie czasu fermentacji. Produkty hydrolizy laktozy s� ponadto znacznie od niej s�odsze. St�d wykorzystanie do produkcji jogurt�w mleka ze zhydrolizowanym di- sacharydem eliminuje koniecznoS� dodawania do nich sacharozy jako Srodka s�o- dz�cego, co znacznie obni�a kalorycznoS� gotowych wyrob�w. BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 57 Marta Wanarska, J�zef Kur Mleko o obni�onej zawartoSci laktozy stosowa� mo�na do produkcji mleka skondensowanego i lod�w w celu wyeliminowania wady piaszczystoSci , kt�ra pro- wadzi do pogorszenia ich w�aSciwoSci organoleptycznych. M�czny lub piaszczysty posmak produkt�w powstaje na skutek krystalizacji laktozy podczas zag�szczania lub/i pod wp�ywem niskiej temperatury stosowanej w procesach technologicznych. Dodatek -D-galaktozydazy przy produkcji twarogu skraca czas krzepni�cia mle- ka, zaS sery wyprodukowane z mleka z dodatkiem enzymu szybciej dojrzewaj�. Enzymatyczna hydroliza laktozy zawartej w serwatce prowadzi do otrzymania syropu glukozowo-galaktozowego. Syrop ten mo�e zast�pi� mleko odt�uszczone i sacharoz� w produktach piekarskich, cukierniczych i mro�onych produktach mlecznych. Mo�na go te� stosowa� jako zamiennik cukru czy syropu glukozowego w produkcji napoj�w. Suszona serwatka ze zhydrolizowan� laktoz� mo�e by� wykorzystana r�wnie� jako dodatek do pasz dla trzody chlewnej, byd�a i zwierz�t futerkowych. Zagospo- darowanie serwatki b�d�cej uci��liwym produktem ubocznym przemys�u mleczar- skiego ma ogromne znaczenie dla ochrony Srodowiska. Obecnie znaczna cz�S� ser- watki traktowana jest jako odpad i podlega utylizacji lub czasami trafia do Sciek�w. Wykorzystanie transglikozylacyjnej aktywnoSci -D-galaktozydazy umo�liwia pro- dukcj� oligosacharyd�w glukozowo-galaktozowych, stosowanych jako cenne dodat- ki do �ywnoSci. Ze wzgl�du na swoje w�aSciwoSci, oligosacharydy zaliczone zosta�y do sk�adnik�w �ywnoSci funkcjonalnej, czyli takiej, kt�ra opr�cz tradycyjnie uzna- nej wartoSci od�ywczej, wywiera r�wnie� korzystny wp�yw na zdrowie cz�owieka. Od 1991 r., kiedy Ministerstwo Zdrowia i Opieki Spo�ecznej Japonii nada�o status FOSHU (Foods for Specified Health Use) czterem typom oligocukr�w (fruktooligosacha- rydy, galaktooligosacharydy, palatynozooligosacharydy i oligosacharydy z ziaren soi) (59), prowadzone s� intensywne badania nad w�aSciwoSciami, sposobami pro- dukcji i zastosowaniem r��nych typ�w oligosacharyd�w. Obecnie na Swiecie produ- kuje si� ponad 20 rodzaj�w oligocukr�w nie ulegaj�cych rozk�adowi pod wp�ywem ludzkich enzym�w trawiennych (NDOs). Niekt�re izolowane s� z naturalnych xr�de� na drodze ekstrakcji (oligosacharydy z ziaren soi), otrzymuje si� je r�wnie� poprzez enzymatyczn� hydroliz� polisacharyd�w (ksylo- i izomaltooligosacharydy) lub jako produkt katalizowanej enzymatycznie reakcji transglikozylacji (frukto- i galaktooli- gosacharydy) (59,60). Galaktooligosacharydy (GOS) to w�glowodany z�o�one z cz�steczek D-glukozy i D-galaktozy po��czonych wi�zaniami glikozydowymi. Tak jak inne NDOs, galakto- oligosacharydy nie ulegaj� hydrolizie pod wp�ywem dzia�ania ludzkich enzym�w trawiennych. S� natomiast substratem reakcji fermentacji prowadzonej przez specy- ficzne gatunki bakterii zasiedlaj�ce jelito grube. Podstawow� zalet� GOS (a tak�e in- nych oligosacharyd�w) jest zdolnoS� do stymulowania rozwoju i aktywnoSci szcze- p�w Bifidobacterium i Lactobacillus w okr��nicy. Sprzyja to utrzymaniu r�wnowagi w sk�adzie mikroflory jelitowej, hamuje rozw�j bakterii chorobotw�rczych (Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus) i w efekcie zapobiega infekcjom. Spo�y- 58 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie wanie oligosacharyd�w pomaga te� w odbudowie naturalnej mikroflory jelitowej po kuracji antybiotykowej. Ponadto dieta zawieraj�ca galaktooligosacharydy sprzyja obni�eniu poziomu cholesterolu we krwi, zapobiega nadciSnieniu, a tak�e zmniej- sza ryzyko powstawania nowotwor�w jelita grubego (60,61). Ze wzgl�du na wymie- nione prozdrowotne w�aSciwoSci galaktooligosacharyd�w, znalaz�y one zastosowa- nie jako dodatek do �ywnoSci, g��wnie jogurt�w i napoj�w mlecznych zawiera- j�cych �ywe kultury bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. GOS stosowane s� r�wnie� jako dodatek do od�ywek dla niemowl�t (59). Galaktooligosacharydy nie ulegaj� hydrolizie pod wp�ywem ludzkich enzym�w trawiennych, posiadaj� zatem ni�sz� wartoS� energetyczn� od sacharozy. Dzi�ki temu znalaz�y zastosowanie jako Srodek s�odz�cy przy produkcji napoj�w, s�odyczy, d�em�w, a tak�e pieczywa. Ich du�a zdolnoS� wi�zania wody powoduje ponadto, �e pieczywo d�ugo pozostaje Swie�e. GOS s� odporne na wysok� temperatur� i zacho- wuj� swoje w�aSciwoSci po obr�bce cieplnej �ywnoSci. Na skal� przemys�ow� galaktooligosacharydy produkowane s� z laktozy z zasto- sowaniem enzym�w -D-galaktozydaz wykazuj�cych aktywnoS� transglikozylacyjn�. Komercyjnie dost�pne GOS s� mieszanin� galaktooligosacharyd�w o r��nej d�ugo- Sci, laktozy oraz D-glukozy i D-galaktozy. Procentowy sk�ad mieszaniny i budowa chemiczna oligosacharyd�w uzale�nione s� od xr�d�a enzymu, st��enia substratu i warunk�w prowadzenia reakcji. Stosuj�c -D-galaktozydaz� z Bacillus circulans lub Cryptococcus laurentii uzyskuje si� galaktooligosacharydy, w kt�rych podjednostki cukrowe po��czone s� g��wnie wi�za- niami -1,4-glikozydowymi. Je�eli reakcja transglikozylacji katalizowana jest przez en- zym wyizolowany z Aspergillus oryzae lub Streptococcus thermophilus, w cz�steczkach oli- gocukr�w wyst�puj� przede wszystkim wi�zania -1,6-glikozydowe (60). Ponadto w przypadku stosowania -D-galaktozydazy z A. oryzae g��wnym produktem reakcji s� trisacharydy (57,60,62), zaS u�ycie enzymu z B. circulans pozwala na uzyskanie, obok trisacharyd�w, stosunkowo du�ej iloSci tetra- i pentasacharyd�w (57,60). Najwi�ksza iloS� oligosacharyd�w o stopniu polimeryzacji 3-6 powstaje przy wy- sokim st��eniu laktozy (5,57,60,62). W przypadku niskiego st��enia substratu w mieszaninie reakcyjnej, g��wnymi produktami reakcji s� disacharydy, w kt�rych cz�steczki glukozy i galaktozy po��czone s� innymi wi�zaniami ni� w laktozie al- lolaktoza i galaktobioza (5). St��ony roztw�r laktozy otrzymywany jest g��wnie z serwatki, w kt�rej zawartoS� tego disacharydu dochodzi do 80% suchej masy. Dob�r temperatury i pH w jakich prowadzona jest reakcja transglikozylacji uza- le�niony jest od w�aSciwoSci stosowanej -D-galaktozydazy. Podwy�szenie tempe- ratury wp�ywa przede wszystkim na zwi�kszenie rozpuszczalnoSci laktozy i pozwala uzyska� wy�sze st��enie pocz�tkowe substratu, kt�re ma ogromny wp�yw na wydaj- noS� procesu. Chroni te� przed zanieczyszczeniem Srodowiska reakcji niepo��dan� mikroflor�. WysokoS� temperatury limitowana jest stabilnoSci� termiczn� enzymu. Z tego powodu coraz cz�Sciej prowadzone s� badania nad wykorzystaniem termo- stabilnych -D-galaktozydaz do syntezy oligosacharyd�w (42,63). BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 59 Marta Wanarska, J�zef Kur Wzrastaj�ce zapotrzebowanie na galaktooligosacharydy sk�ania do poszukiwa- nia nowych -D-galaktozydaz wykazuj�cych wysok� aktywnoS� tranglikozylacyjn�, a tak�e wydajnych metod immobilizacji enzym�w pozwalaj�cych na produkcj� GOS w przemys�owych procesach ci�g�ych (22,62,64). W procesach przemys�owych wykorzystywane s� hydrolazy glikozydowe pocho- dz�ce z organizm�w mezofilnych: grzyb�w strz�pkowych Aspergillus niger i Aspergillus oryzae oraz dro�d�y Kluyveromyces lactis i Kluyveromyces fragilis. Enzymy te posiadaj� status substancji GRAS (Generally Recognized as Safe) nadany przez U.S. Food and Drug Administration (FDA) (65). -D-galaktozydazy izolowane z grzyb�w strz�pko- wych, wykazuj�ce wysok� aktywnoS� przy pH 3,5-4,5, stosowane s� do hydrolizy laktozy w kwaSnej serwatce. Natomiast enzymy pochodz�ce z dro�d�y, aktywne w zakresie pH 6,0-7,0, wykorzystuje si� w przetw�rstwie mleka i s�odkiej serwatki (23). 6. Uwagi ko�cowe Enzymy jako katalizatory reakcji chemicznych znalaz�y szerokie zastosowanie w wielu ga��ziach przemys�u. Istnieje jednak wiele problem�w zwi�zanych z ich praktycznym wykorzystaniem. Czynnikiem limituj�cym jest ich wysoka cena. Wi��e si� ona przede wszystkim z du�ymi kosztami zwi�zanymi z ich izolacj� i oczyszcza- niem. Powa�n� wad� katalizator�w bia�kowych jest stosunkowo szybka utrata ak- tywnoSci, zwi�zana z niestabilnoSci� ich struktury, po wyizolowaniu z naturalnego Srodowiska jakim jest �ywa kom�rka. Enzymy s� wra�liwe na zmiany warunk�w fi- zykochemicznych, takich jak: temperatura, pH, czy obecnoS� substancji pe�ni�cych rol� aktywator�w lub inhibitor�w. Przez d�ugi czas uwa�ano r�wnie�, �e biokatali- zatory mog� dzia�a� tylko w Srodowisku wodnym, co znacznie ogranicza�o zakres ich stosowania. Bardzo wa�na dla przydatnoSci enzymu w procesach przemys�o- wych jest cena i iloS� dost�pnego komercyjnie biokatalizatora. Obecnie wi�kszoS� enzym�w wytwarzana jest przez rekombinowane szczepy drobnoustroj�w, dzi�ki czemu s� znacznie ta�sze od bia�ek wyizolowanych z kom�rek ich naturalnego pro- ducenta. Biosynteza termostabilnych -D-galaktozydaz w kom�rkach mezofilnych gospodarzy (np. E. coli), znacznie u�atwia proces ich oczyszczania. Znaczn� czystoS� preparatu mo�na uzyska� ju� we wst�pnym etapie polegaj�cym na termicznej dena- turacji bia�ek mezofilnego mikroorganizmu. Uproszczenie metodyki oczyszczania bioproduktu zwi�ksza wydajnoS� procesu i znacznie redukuje zwi�zane z nim kosz- ty. Ponadto zwarta struktura cz�steczek termostabilnych bia�ek sprawia, �e s� one mniej podatne na zmiany konformacji spowodowane tworzeniem wi�za� pomi�dzy enzymem a z�o�em w procesie immobilizacji. Dzi�ki temu unieruchomione termo- stabilne biokatalizatory zachowuj� wysok� aktywnoS�. Immobilizacja -D-galakto- zydaz umo�liwia stosowanie ich w procesach ci�g�ych. W tym przypadku wyst�puje jednak du�e prawdopodobie�stwo zanieczyszczenia mikrobiologicznego bioreakto- 60 PRACE PRZEGL�DOWE -D-galaktozydazy xr�d�a, w�aSciwoSci i zastosowanie ra. Prowadzenie reakcji w wysokiej temperaturze z zastosowaniem enzym�w ter- mostabilnych ca�kowicie eliminuje to niebezpiecze�stwo. Pozwala r�wnie� na jed- noczesne wytwarzanie produkt�w i ich obr�bk� ciepln�, co jest niezwykle u�ytecz- ne w przemySle spo�ywczym. Literatura 1. Kirk O., Borchert T. V., Fuglsang C. C., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 345-351. 2. Rasor J. P., Voss E., (2001), Appl. Catal. A: General., 221, 145-158. 3. van Beilen J. B., Li Z., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 338-344. 4. Synowiecki J., (1998), Biotechnologia, 3, 42, 98-105. 5. Mahoney R. R., (1998), Food Chem., 63, 147-154. 6. Stevenson D. E., Stanley R. A., Furneaux R. H., (1993), Biotechnol. Bioeng., 42, 657-666. 7. Scheckermann C., Wagner F., Fischer L., (1997), Enzyme Microb. Technol., 20, 629-634. 8. van Rantwijk F., Woudenberg-van Oosterom M., Sheldon R. A., (1999), J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 6, 511-532. 9. van Laere K. M. J., Abee T., Schols H. A., Beldman G., Voragen A. G. J., (2000), Appl. Environ. Micro- biol., 66, 1379-1384. 10. Vetere A., Paoletti S., (1998), Biochim. Biophys. Acta, 1380, 223-231. 11. Widmer F., Leuba J-L., (1979), Eur. J. Biochem., 100, 559-567. 12. van Casteren W. H. M., Eimermann M., van den Broek L. A. M., Vincken J-P., Schols H. A., Voragen A. G. J., (2000), Carb. Res., 329, 75-85. 13. Tanaka Y., Kagamiishi A., Kiuchi A., Horiuchi T., (1975), J. Biochem., 77, 241-247. 14. Akasaki M., Suzuki M., Funakoshi I., Yamashina I., (1976), J. Biochem., 80, 1195-1200. 15. Ladero M., Santos A., Garcia J. L., Carrascosa A. V., Pessela B. C. C., Garcia-Ochoa F., (2002), Enzyme Microb. Technol., 30, 392-405. 16. Dickson R. C., Dickson L. R., Markin J. S., (1979), J. Bacteriol., 137, 51-61. 17. Sheridan P. P., Brenchley J. E., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, 2438-2444. 18. Jacobson R. H., Zhang X-J., DuBose R. F., Matthews B. W., (1994), Nature, 369, 761-766. 19. Coker J. A., Sheridan P. P., Loveland-Curtze J., Gutshall K. R., Auman A. J., Brenchley J. E., (2003), J. Bacteriol., 185, 5473-5482. 20. Turkiewicz M., Kur J., Bia�kowska A., CieSli�ski H., Kalinowska H., Bielecki S., (2003), Biomol. Eng., 20, 317-324. 21. Nagy Z., Kiss T., Szentirmai A., Biro S., (2001), Protein Expr. Purif., 21, 24-29. 22. Onishi N., Tanaka T., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, 4026-4030. 23. Kowalewska-Piontas J., (1993), Przegl�d Mleczarski, 3, 197-200. 24. Holmes M. L., Scopes R. K., Moritz R. L., Simpson R. J., Englert C., Pfeifer F., Dyall-Smith M. L., (1997), Biochim. Biophys. Acta, 1337, 276-286. 25. CieSli�ski H., Kur J., Bia�kowska A., Baran I., Makowski K., Turkiewicz M., (2005), Protein Expr. Pu- rif., 39, 27-34. 26. Synowiecki J., Maciu�ska J., (2000), Biotechnologia, 1, 48, 117-123. 27. Nucci R., Moracci M., Vaccaro C., Vespa N., Rossi M., (1993), Biotechnol. Appl. Biochem., 17, 239-250. 28. Kengen S. W. M., Luesink E. J., Stams A. J. M., Zehnder A. J. B., (1993), Eur. J. Biochem., 213, 305-312. 29. Onishi N., Tanaka T., (1996), J. Ferment. Bioeng., 82, 439-443. 30. Huang D. Q., Prevost H., Divies C., (1995), Int. Dairy J., 5, 29-43. 31. Ismail S. A., Mabrouk S. S., Mahoney R. R., (1997), J. Food Biochem., 21, 145-162. 32. Cowan D. A., Daniel R. M., Martin A. M., Morgan H. W., (1984), Biotechnol. Bioeng., 26, 1141-1145. 33. Ulrich J. T., McFeters G. A., Temple K. L., (1972), J. Bacteriol., 110, 691-698. BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005 61 Marta Wanarska, J�zef Kur 34. Vian A., Carrascosa A. V., Garcia J. L., Cortes E., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, 2187-2191. 35. Ohtsu N., Motoshima H., Goto K., Tsukasaki F., Matsuzawa H., (1998), Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1539-1545. 36. Hidaka M., Fushinobu S., Ohtsu N., Motoshima H., Matsuzawa H., Shoun H., Wakagi T., (2002), J. Mol. Biol., 322, 79-91. 37. Berger J-L., Lee B. H., Lacroix C., (1997), Biotechnol. Appl. Biochem., 25, 29-41. 38. Shaikh S. A., Khire J. M., Khan M. I., (1999), Biochim. Biophys. Acta, 1472, 314-322. 39. Batra N., Singh J., Banerjee U. C., Patnaik P. R., Sobti R. C., (2002), Biotechnol. Appl. Biochem., 36, 1-6. 40. Pisani F. M., Rella R., Raia C. A., Rozzo C., Nucci R., Gambacorta A., de Rosa M., Rossi M., (1990), Eur. J. Biochem., 187, 321-328. 41. Petzelbauer I., Nidetzky B., Haltrich D., Kulbe K. D., (1999), Biotechnol. Bioeng., 64, 322-332. 42. Petzelbauer I., Zeleny R., Reiter A., Kulbe K. D., Nidetzky B., (2000), Biotechnol. Bioeng., 69, 140-149. 43. Moracci M., Nucci R., Febbraio F., Vaccaro C., Vespa N., la Cara F., Rossi M., (1995), Enzyme Microb. Technol., 17, 992-997. 44. Pessela B. C. C., Vian A., Mateo C., Fernandez-Lafuente R., Garcia J. L., Guisan J. M., Carrascosa A. V., (2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 1967-1972. 45. D�browski S., Maciu�ska J., Synowiecki J., (1998), Mol. Biotechnol., 10, 217 222. 46. Maciu�ska J., (1999), Otrzymywanie i w�aSciwoSci termostabilnych -D-galaktozydaz wytwarzanych przez Thermus thermophilus i zmodyfikowan� genetycznie Escherichia coli, rozprawa doktorska, Politechnika Gda�ska. 47. Wanarska M., (2005), Termostabilna -D-galaktozydaza Pyrococcus woesei konstrukcja nowych syste- m�w ekspresyjnych, oczyszczanie, charakterystyka i immobilizacja enzymu, rozprawa doktorska, Poli- technika Gda�ska. 48. www.prozyme.com 49. Reithel F. J., Newton R. M., Eagleson M., (1966), Nature, 210, 1265. 50. Shifrin S., Grochowski B. J., Luborsky S. W., (1970), Nature, 227, 608-609. 51. Lederberg J., (1950), J. Bacteriol., 60, 381-392. 52. Ladero M., Santos A., Garcia J. L., Garcia-Ochoa F., (2001), Enzyme Microb. Technol., 29, 181-193. 53. Onishi N., Yamashiro A., Yokozeki K., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, 4022-4025. 54. Roy I., Gupta M. N., (2003), Proc. Biochem., 39, 325-332. 55. Santos A., Ladero M., Garcia-Ochoa F., (1998), Enzyme Microb. Technol., 22, 558-567. 56. Rustom I. Y. S., Foda M. I., Lopez-Leiva M. H., (1998), Food Chem., 62, 141-147. 57. Boon M. A., Janssen A. E. M., van t Riet K., (2000), Enzyme Microb. Technol., 26, 271-281. 58. Bielecka M., (1998), Przemys� Spo�ywczy, 52, 13-15. 59. Crittenden R. G., Playne M. J., (1996), Trends Food Sci. Technol., 7, 353-361. 60. Sako T., Matsumoto K., Tanaka R., (1999), Int. Dairy J., 9, 69-80. 61. Demczuk A., Bednarski W., Kowalewska-Piontas J., (2004), Biotechnologia 3, 66, 152-165. 62. Lopez Leiva M. H., Guzman M., (1995), Proc. Biochem., 30, 757-762. 63. Reuter S., Rusborg Nygaard A., Zimmermann W., (1999), Enzyme Microb. Technol., 25, 509-516. 64. Shin H-J., Park J-M., Yang J-W., (1998), Proc. Biochem., 33, 787-792. 65. www.fda.gov 62 PRACE PRZEGL�DOWE

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Krzywe rotacji galaktyk
UCIECZKA GALAKTYK
galaktozydaza
GALAKTOZA
WAĹ»ENIE GALAKTYK
13 Akrecja w aktywnych jądrach galaktyk
Rozmowa Galaktyk
(galaktyczne fontanny)
12 Akrecja na gwiazdy neutronowe i galaktyczne czarne dziury

więcej podobnych podstron