42904

3. Elongacja. polimeraza dodaje po jednym nukleotydzie od miejsca przyłączania startera syntetyzując komplemcutraną kopię matrycy DNA. Temp wzrasta do optymalnej temp dla aktywności polimerazy -72 st. (2min tylko dNTPs)

Etapy te tworzą 1 cykl. Takich cykli potrzebnych jest 30 - 40. Wynikiem całego procesu jest wykładnicza produkcja sekwencji docelowej w liczbie kopii 2"(n-liczba cykli). Cecliy primerów - długość max do 30 nukleotydów. temp w tomocykleize ustawić gradient

Wykorzystanie reakcji PCR

1.    prenatalna diagnostyka mutacji genów, np. w^r niedokrwistości sierpowTrtej, feny lok et onurii. hemofilii,

mukowiscydozie.

2.    diagnostycznego wykrywania docelowych sekwencji DNA (wykrywania wirusa HIV. prątków gruźlicy)

3.    przeszukiwania genomu pod kątan mutacji, sekwencji powtarzalnych w DNA

4.    w medycynie sądowej do badania znikomych ilości DNA w celu porównania z materiałem genetycznym od poszczególnych podejrzanych.

Problemy z reakcją PCR.

1.    kontaminacja - (zanieczyszczenie próbki) zafałszowanie pozytywnych wyników poprzez przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plasiki lub sprzęt laboratoryjny

2.    do zapoczątkowania reakcji PCR konieczne są startery

3.    dokładnych badań ilościowych RT - PCR.

Rodzaje reakcji PCR:

1.    Multipleks PCR

2.    Nested PCR - wewnętr zny PCR

3.    RT - PCR

4.    RACE-PCR

5.    ASA

6.    REP-PCR

7.    OLA

8.    AS - PCR asymetryczny PCR

9.    RAPD - PCR

1983 - Karry Mullits, 1993r. - nagroda Nobla.

RT - PCR służy do badania mRNA.

Reakcję poprzedza się przepisaniem sekwencji zawartej wyłącznie w dojrzałym mRNA.

1.    Dzięki tej metodzie możemy stwier dzić obecność określonych tran skryptów genu i okr eślić ich ilość.

2.    w' reakcji odwrotnej tr anskrypcji poza matrycą RNA niezbędna jest polimeraza DNA zależna od RNA(odwrotna (ranskyptaza)

3.    produkt reakcji RT - PCR można badać za pomocą testu syntezy białka in vitro IVTT - PTT. RT -PCR jest pierwszym etapem w PTT, w którym jeden starter zawiera sekwencje inicjujące przepisywane na cDNA oraz sekwencje inicjujące tr anslację - syntezę in vitro białka na bazie cDNA.

4.    rozdział elektrofor etyczny pizeniesienie na błonę mikrocehilozową ocenia się długość zsyntetyzowanego białka.

RACE - PCR Celon jest poznanie dokładnej sekweneji jednego z końców RNA. Stosujony metodę VRACE lub SRACE.

ASA - amplifikacja allclo-specyficzna (PASA -PCR ASA. ASP -allelospecyfico PCR). Metoda wykrywania polimorfizmu allcli i mutacji punktowych.

Hybrydyzacja ASO - połączenie techniki PCR i hybrydyzacji. Hybrydyzacja z sondą specyficzną dla produktu PCR. Sonda rozpoznaje allel prawidłowy lub zmutowany.