107930

Sposoby atenuacji:

-^osłabienie szczepu=> mtiiageneza=> pasażów anie

Szczepionka nowej generacji (chromosom Listeria + obce antygeny np. nukleoproteiny wirusa grypy...antygeny nowotworowe=> szczepionki przeciwnowotworowe)

Przewaga szczepionek nowej generacji nad starymi!!!© Pytanie?

Użycie bakterii -> patogennej

->niepatogennej z czynnikami patogenezy

WYSPY PATOGENNOŚCI- Kodują zespół czynników wirulencji, na chromosomie hib plazmidzie PCR:

-łańcuchowa reakcja polimerazy

-metoda powielania DNA in vitro. polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Powielony frag. Nie musi być oddzielony od reszty genomu, po amplifikacji odzielamy fragment dzięki ELEKTROFOREZIE w żelu agarozowym

Wykorzystanie B. Subtilis jako nośnika antygenów:

->zawiera wklonowany do kasety SPAĆ gen kodujące hemolizynę L monocytogenes->nabycie cech patogena->zdolność do wnikania do komórki

->doklonowame do kasety genu kodującego białko przeciw któremu chcemy wywołać odpowiedź immunologiczną

ĆWICZENIE:

1.Izolacja DNA B.subtilis

Żwirować nocną hodowlę-> zlać supematant->osad zawiesić w SSC (NaCl+cytrynian s odu)-* żwirować-> z lać supernatant-^osad zawiesić w buforze lizującym (bufor fosforanowy+sacharoza+lizozym)->inkubować->dodać roztworu lizującego ściany mureinowe (Tris+EDTA⁺SDS)->inkubować w 37->inkubować w 75stopniach->próbkę zwotteksować i wirować-> pobrać supernatant-> dodać do supernatantu bufor ORANGE-DX i wymieszać-^ mieszaninę przenieść do minikolumny-*wirować->wyrzucić przesącz->umieścić minikolumnę w probówce odbierającej-> dodać buforu phiczącego Wash-DX->wirować->znowu wylać-świrować w celu usumęcia resztek buforu płuczącego->miiukolumnę umieścić w sterylnym eppendorfie-^dodać buforu Elution-DX -^pozostawić ją na 2 min w temp. Pokojowej-^ żwirować i mamy!

Składniki PCR:

-matryciwy DNA -> nasz preparat -dNTP -^roztwór triiuikleotydów

-sekw. Flankujące interesujące nas geny -Oprawy i lewy primer •termostabilną polimerazę •woda dejonizowana -bufor

Analiza produktów PCR:

Do próbki dodać barwnik->nanieść do dołków->nałożyć wzorzec->rozdzielać w żehi agarozowym->żel zabarwić bromkiem etydyny

KREW+TOKSYNY BAKTERYJNE->LIZA Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego:

Przygotowanie krwi baranka:

Odphikaiue osocza od erytrocytów

-krew zawiesić w PBS(sól fizjologiczna buforowana)-^ żwirować-Podrzucić supernatant-> krwinki zawiesić

w PBS-Opłukać 3 razy

Przygotowanie próbek do testu

PBS+zawiesina erytrocytów preinkubować

Do probówek z erytrocytami i PBS dodać:

Supernatant znad badanych szczepów    SDS    woda

0 0 0 0 00 000