101958

•    Brak aktywności egzonułdeazy 3’-5’, dzięki czemu enzym nie usuwa ddN kończących łańcuch po ich włączeniu

•    Brak aktywności egzonułdeazy 5’-3’ (lub nieznaczna), co umożliwia usuwanie mci DNA już związanego z matiycą, dzięki niej nowosyntetyzowany łańcuch nie jest skracany

•    Wysoka procesywność, tj zdolność do tworzenia stosunkowo długich fragmentów DNA zanim nastąpi terminacja reakcji

•    Żaden naturalny enzym nie spełnia wszystkich tych kryteriów, dlatego stosuje się sztucznie modyfikowane białka (np. fragment Klenov- polimeraza DNA I pozbawiona aktywności 5’-3; przez odcięcie pewnej części białka (ale ma ona wtedy dosyć niską procesywność). Najbliższa ideału jest sekwenaza (nazwa handlowa)

Projekt sekwencjonowania genomu ludzkiego (HGP- Humań Genome Project)

Gilbert, koszt 3 mld S, 1988 Przeciwnicy:

•    Wskazanie źródeł finansowania

•    Ograniczenie dotacji na inne badania

•    Mała atrakcyjność naukowa, wyzwania natury technicznej niż intelektualnej

•    Dlaczego cały genom, skoro geny to nieznaczna część i na ich poznaniu powinny się skupić badaiua

Za:

•    Doskonalenie narzędzi

•    Sekwencjonowanie genomów małycli da wiedzę niezbędną do zaatakowania głównego celu

•    Postęp w mapowaniu

Mapowanie genetyczne- ustalenie względnych pozycji czyli kolejności ułożenia sekwencji wzdłuż chromosomu (no gen 2 leży między 1 i 3)

Mapowanie fizyczne- ustalenie bezwzględnej pozycji i odległości między sekwencjami na chromosomie. Można stwierdzić, że gen 2 znajduje się w odległości miliona pz od genu 1 i trzech milionów od genu 3

Mapowanie genetyczne- ogólna struktura genomu. Fizyczne- dokładnie określa położenie danej sekwencji na chromosomie, wyznacza też dalsze kierunki analiz.

Technika chromosome walking

Metoda genome shotgun (Venter):

Strzał w ślepo milowy krok w poznawaniu genomów- DNA poddawany jest losowej fragmentacji (restryktazy).

Każdy z odcinków DNA sekwencjonowano, składano komputerowo w całość na podstawie analizy sekwencji zachodzących na siebie fragmentów (ustalony algorytm).

Pierwouńe opracowana w odniesieniu do prostych genomów (małe rozmiary, niewiele elementów powtarzających się typowych dla wyższych Eukaryota).

Eliminowała metody polegające na czasochłonnych tworzeniu subklonów, ich mapowaniu i składaniu w większą całość.

Wielkości genomów:

Prokaryota: 1 do kilku min Eukaryota:

Drożdże: 12

Rośliny: 100-400 min, ale też 17-120 mld.

Człowiek: 3 mld

Co z sekwencjonowaniem?