55294

wyznać znai Km i V max Wtedy znajdowane Km jest Km app to samo czynimy dla drugiego substratu i wsyznaczoamy dla niego Km

czynniki wpływające na szybkość reakcji

Ze zwiększeniem stęż enzymu zwiększa się szybkość i absorbacja przestanie być liniowa bo znacząco zmienisza się stężenie substratu

Może sugerować błędnie rakcje z inhibitorem

Pomiary szybkości początkowej są wiarygodne gdy zużycie substratu nie przekracza 10%

Ogólnie najlepsza zdolność buforowania jest o jednostę powyżej i poniżej pK,

Rozcieńczone bufory zmienaiją pH w niewielkim stopniu w stosunku do roztworu wyjściowego ale trzeba to sprawdzać tym bardziej że temperatura zmienia pKa buforu Trzeba kalibrować pH-metr na temperaturę w ktroej prowadzi się pomiar. Jeśli mierzymy wpyw temperatruy na aktywność enzymu (oczwiście w stałym pH) to trzeba wybrać bufor PIPES, MOPS o niskiej wartości delta pKa/°C

(woda destylowana jest kwaśna)

Sprawdzając wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej. Trzeba przygotwoać różne bufory o nadkąłdających się stezenaich i sprawdzić czy ich ich skąd nie zmienai syzbkości reakcji

Wyznaczanie energii aktywancji

Jeśli wykreśliliśmy log (kcat( reakcji w zależności od 1/2,3RT to otrzymamy linię prosta o nacyleniu -Ea Energia aktywacji będzie w kcal/mol w mc Kcat możemy wstawić V max gdyż Vmax = k2 [Et]

wykres Arheniusa

pozwala wyznaczyć w przypadku stało i zmienno cieplnych zwirząt - energai aktywancji ich enzymów

Większość pomiarów prowadzi się w 28 lub 37 °C (w zależności od enzymu)

(substart rozpoczoynający reakcje powinien być ogrzany

enzymy dodajemy w ilości 10-50 pl/lml mieszaniny o rwónoważonej temperaturze wtedy enzym ogrzeewa się w trakcjie miesznaia

Wyrażanie aktywności enzymów

w jednostkach międzynarodowcy lub jed/mg białka - aktywność specyficzna (właściwa) liczba obrotów (aktywność cząstekczowkao to liczba moli substrató przemienieonego w ciągu min przez mol enzymu (jednostki / p mol enzymu)

stężenie substartu w nieoczyscoznycm preparacej podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg białak Miesrzym się ją przy nasycającym seżeniu substartu (v~V max) i optymalnych warunkach pH i temp dla makymalnej aktywności

warunki optyamalne do stabliności (przechowaywania) nie są toższame z warunkami reakcji w glicerolu

szybko zamrozić rozmarażanie powoli