84755

Dwunciowe DNA

Kolonie

I lin komórek I (chloroform)

Przeciwciała przyczepione do zlzowartych komórek zawierających

-Ca-

• Hybrydyzacja heterologiczna w obrębie gatunku ma na celu zbadanie podobieństw w obrębie rodzin tych samych białek.

Szukamy ostatniej sytuacji...

Mamy sondę, która tylko częściowo hybrydyzuje z sekwencją docelową. Podobieństwo białek należących do rodziny nigdy nie jest 100%.

Te same aminokwasy - DNA może się różnić. Doświadczenia te doprowadziły do wielu odkryć rodzin, np. kinaz, białek homeolycznych.

Hybryda dwóch związanych ze sobą nld ONA

Parowanie wystarczające do uformowania stabilnej struktury

• przypadek w którym nie dysponujemy informacją na temat sekwencji DNA, czy białek. W tym celu musimy dysponować pizeciwciałami do określonych białek oraz    ¹²¹¹ taką. w której

klony podlegają ekspresji.

Wjaki sposób otrzymujemy bibliotekę ekspresyjną?

Potrzebujemy wektory, które posiadają promotor aktywny w komórce bakteryjnej. Pod jego kontrolą znajdują się inserty. Otrzymuje się cDNA. Następnie biblioteka ta jest ligowana z wektorem ekspresyjnym. Oczywiście mamy przeróżne fragmenty DNA, ale niektóre cDNA pod kontrolą promotora bakteryjnego ulegają ekspresji takiej, źc dają produkt polipeptydowy. Istotą znalezienia sekwencji kodującej jest odnalezienie klonu, w którym ta ekspresja zachodzi

IAtUch sttcłcy ends, igJte

Jedyna różnica między biblioteką eksresyjną, a zwykłą jest ni i li miliw

Immunoscreening

Przeszukiwanie za pomocą przeciwciał:

Immunoscreening

1 Dodanie specyficznych przeciwciał

Białko A - zaznakowane izotopem jodu, pochodzenie bakteryjne, bardzo silnie wiąże immunoglobuliny.

Charakterystyka fagemidu pBlueScript SK (+)

Fagcmid - wektor, który zawiera fragmenty i faga i plazmidu.

Fagemidy pBluescript II SK (+/-)

ampidlin cecha nadająca oporność na ampicilinę ori - miejsce z wektora pUC P lac - promotor, który jest pochodną promotora z operonu laktozowego (promotor aktywny w komórce bakteryjnej)

lac Z’ zatem może służyć do selekcji biało niebieskiej MCS - sekwencja wielokrotnego klonowania (zawiera również promotory polimerazy T2 i T3).