84758

jeżeli teraz RNA zostanie zdegradowane np przez zmianę pH na alkaliczne, to co się stanie? No po prostu dostaniemy frag. Które będą odpowiadały czemu? No będą odpowiadały dokłądnie sekwencjom egzonowym No oczywiście nie będzie to dokładnie sekwencja egzonowa, bo nukleaza może też jakieś końce ponadtrawiać, w sytuacji kiedy struktura nie jest do końca zamknięta. No ale jakieś wyobrażenie o wielkości sekwencji egzonowych po takim eksp Można już mieć. Wielkość tych egzonów można wyznaczyć naturalnie, pytacie się Państwo jak, no oczywiści pizez elektroforezę, i to jest właściwie cala inf. jaką można w tym eksp. Uzyskać Informacja, która pozwala na określenie wielkości egzonów. Illtronów też oczywiście, przez zsumowanie wielkości egzonów, ale na tym się kończy. Eksp. Warty jest zauważenie, ze względu na znaczenie historyczne. Teraz chciałem, przejść do głównych problemów, mianowicie jak przy pomocy hybrydyzacji bo tu też była hybrydyzacja, można wyznaczyć sekwencje 5' końca transkryptu, tę istotną inf. o miejscu startu transkrypcji. Pierwszą metodą jest metoda, która wykorzystuje nukleazę SI Też nukleazę SI Otóż, jeszcze raz, celem eksperymentu jest znakowanie 5' końca tr anskryptu Określenie w którym miejscu transkrypcja się rozpoczyna No i eksperyment jest schematycznie przedstawiony. On jest podzielony na części, zwr óćcie uwagę od razu państwo i będziemy go teraz po kolei omawiali Aby wykonać taki eksperyment musimy dysponować oczywiście sekwencją genu. Są różne warianty tej metody. Jeden z nich zilustrowałem na schemacie Wymaga tego aby gen występował, może na razie w ten sposób. Mamy pokazany ten gen na samej górze schematu. Widzą państwo sekwencję, która jest sekwencją kodującą. To jest to pogrubione. Natomiast ta sekwencja niepogrubiona to jest po prostu hm., dziwne. (PROBLEMY TECHN1CZE). No więc, co jest zaznaczone. Cienką kreską to jest sekwencja niekodująca Sek. która nie podlega transkrypcji To jest region 5', albo region upstream', który nie koduje, ale któy podlega transkrypcji Transkryp zawsze jest większy niż to co jest zbudowane przez trans krypt Więc w tym regionie musi się gdzieś rozgrywać to czego poszukujemy, czyli inicjacja transkrypcji Pytanie jest takie w którym miejscu ta inicjacja się zaczyna- tu, tu, może gdzieś tutaj. I to próbujemy w tym eksperymencie z nukleazą SI określić I teraz w szczegółach jak to robimy. Frag, któy tutaj widzicie jest wybrany w jakiś sposób Mianowicie wybrany jest przez miejsca restrykcyjne On ma długość 400 bp. No i to jest pewna w'skazów'ka. W tym eksperymencie ten fragment, który wybieramy z tego rejonu analizowanego powinien mieć wlaśiue długość 300-400 bp. No i jak go wyciągnąć? No są różne sposoby, najprostrzy jest tutaj pokazany, np przez wycięcie go w oparciu o jakieś miejsca restrykcyjne. W tym konkretnym przypadku to są miejsca rozpoznawane pr zez nukleazę Sau3A. Równie dobrze można sobie wyobrazić, że można by go zampliftkow^rać przez PCR tak zwany. Ale do tego wrócimy. Teraz fragment jest następnie wklonowywane do wektora M13 . Po co? O tóż wektor M13 pozwala nam, jak Państwo pamiętacie, pozwala nam otrzymać DNA w postaci pojedynczej nici. I to bardzo ułatwia dalszy przebieg eksperymentu. Są w'arianty trawienia nukleazą SI, gdzie nie klonuje się w M13. Ale tak jak mówię, takie postępowanie bardzo ulątwio otrzymanie dobrego wyniku A więc otrzymujemy ten fragment, proszę poparzeć na schemat, ten który wybrany jest przez miesjca rest., otrzymujemy go w wektorze M13. Po przejściu przez M13 otrzymujemy kolisty DNA wektora zawierający nasz frag. W postaci pojedynczej mci. W następnym etapie ekpseryrnentu z tą kolista cząsteczką DNA, zawierającą fragmenty danego genu, jest hybrydyzowany z rnRNA. Ten tuRNA dodajmy, nie musi być oczysczony, to może być preparat heterogenny Ale przecież, z tą konkretną sekwencją w wanuikach eksperymentu hybrydyzttją tylko właściwe cząsteczki rnRNA. Jasne? Do tej pory wszystko jest jasne proszę Państwa? Jak nie, to pytajcie mnie... (cisza na sali)

To nie jest prosty eksperyment, ale starałem go się na tyle na ile mogłem go. Jeszcze raz szybko podsumujmy co się stało: wyjęliśmy fragment z genu, poprzez wycięcie go enzymem restrykcyjnym; on obejmuje część sekwencji, która jest sekwencją kodującą, transkrypcja biegnie prawda, z któregoś miejsca tutaj, w tym kierunku, ten frag Został wklonowany do wektora Ml3, co posłużyło do otrzymania, DNA w postaci pojedynczej nici, po to aby ona łatwo mogła hybrydyzować z transkiyptem To jest wyjaśnienie dlaczego przejście na pojedynczą nić. Jasne? No i cal szczęście..

Dalej. To co widzicie państwo na samej górze, to już widzieliśmy w trakcie. Czyli mamy kolistą