84766

•    Białko po fałdowaniu przyjmuję strukturę trzeciorzędową, która określa jego aktywność (ten paradygmat nie jest związany z problemami ekspresji w E. coli).

e)    Różne kodony są używane w różnych organizmach tzn. ten sam kodon może kodować różne aminokwasy w różnych organizmach.

•    Rozwiązanie problemu: syntetyczny gen.

f)    Brak mostków disiarczkowych:

W cytoplazmie E. coli panuje silnie redukujące środowisko, zatem w białka, w których powinny powstać mostki di siarczkowe takich mostków nie będą miały. W takich przypadkach brak czynnika stabilizującego strukturę i często dochodzi do nieprawidłowego fałdowania.

•    Rozwiązanie problemu:

o Zastosowanie specjalnych szczepów i wektorów bakteryjnych, o Eksport białka ekspresjonowanego z cytoplazmy do peryplazmy. W peryplazmie nie jest już tak redukcyjne środowisko i tu mogą tworzyć się mostki disiarczkowe. Dodatkowo często nadekspresjonuje się białka cza peronowe, które też są kierowane do peryplazmy i tu pomagają w fałdowaniu się białka nadekspresjonowanego. Aby białko mogło być skierowane do peryplazmy,    wymaga przyłączenia    peptydu    kierującego. Ilość

ekspresjonowanego białka w peryplazmie jest mniejsza niż w cytoplazmie. o Fałdowanie poza komórką w warunkach utleniających.

2. Eksperymenty nadekspresji są w sprzeczności.

Wynika to z tego, że podczas eksperymentu dążymy do maksymalizacji ilości białka, które jest nadekspresjonowane. Do maksymalizacji ilości białka stosujemy wektory z silnymi promotorami po to aby powstało jak najwięcej transkryptów i jak najwięcej białek. Często to powoduje problemy. Jeżeli jest bardzo dużo produktów transkrypcji czyli również dużo polipeptydu(duże stężenie białka) powoduje to dotąd nieopisane reakcje obronne. W wyniku czego nadekspresjonowane białko ulega degradacji, anormalnemu fałdowaniu i tworzy tzw. ciała strącone (ang. Inclusion bodies).

Inclusion bodies to struktury, gdzie białko nadekspresjonowane jest wyłączane z cytoplazmy komórki prokariotycznej. Z inclusion bodies ciężko jest sobie poradzi. Można próbować doprowadzić do tego, aby one nie powstawały, albo aby powstawały w niewielkich ilościach i towarzyszyło im białko w formie rozpuszczalnej. Jest to możliwe np. przez:

•    obniżenie wydajności promotora (obniżenie wydajności transkryptu czyli również ilości białka),

•    obniżenie temperatury nadekspresji.

Nuctootd

Inclusion bodies niosą również pewne korzyści:

Zawarte jest w nich białko nadekspresjonowane w czystej formie, ale zdenaturowane. Jeżeli wyizolujemy ciałka strącone to mamy białko w formie czystej, ale denaturowane. Są jednak sposoby na renaturację takiego białka, chociaż renaturacja nie zawsze kończy się sukcesem.

Ciałka strącone mogą powstawać również z powodu takiego, że białka nic fałdują się dobrze dlatego, że w cytoplazmie E. coli panuje silnie redukujące środowisko (nie tworzą się mostki disiarczkowe).