84871

S Do probówki dodaliśmy 2ml buforu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5 a następnie wyzerowaliśmy spektrofotometr przy długości fali 280 nm wobec buforu w probówce użytego jako odnośnik S Po opróżnieniu i osuszeniu kuwety wlaliśmy do niej 2ml otrzymanego ( wyjściowego roztworu białka aldolazy A S Zmierzyliśmy absorbancję przy długości fali 280nm S W probówce rozcieńczyliśmy wyjściowy roztwór białka za pomocą buforu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5 do sumarycznej objętości 4.5 ml 0,885

—— = 2,21

0.4

= 2,04

4.5

2^21

bufor: 4,5-2,04=2,46

My do pomiaru wzięliśmy 2ml roztworu wyjściowego białka i 2,5ml buforu

R=—— = 2,25 2,00

S Wyzerowaliśmy spektrofotometr i napełniliśmy kuwetę 2ml rozcieńczonego roztworu białka i zmierzyliśmy absorbancję przy długości fali 280nm

b)    Oznaczanie „wszystkich" grup SH w białku

S W probówce rozcieńczyliśmy dwukrotnie roztwór ((10mM Tris-HCI, 2mM EDTA o pH 7.5 + 4%SDS ) za pomocą roztworu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5 do końcowej objętości równej 9ml ( R=2 dodaliśmy 4,5ml buforu i 4,5 ml buforu z SDS)

S Do probówki odnośnikowej dodaliśmy 2ml rozcieńczonego roztworu białka S Do probówek podpisanych „próbka" dodaliśmy po lml rozcieńczonego

roztworu białka i lml wyjściowego roztworu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA o pH

7.5    + 4%SDS)

S Po wymieszaniu do wszystkich probówek dodaliśmy sól potasową kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5 w objętości 0,lml dzięki czemu otrzymaliśmy 20-krotne rozcieńczenie 2ml+x=20x 2ml=19x x=0,lml

S Pozostawiliśmy probówki w temperaturze pokojowej na 15min S Zmierzyliśmy absorbancję badanej próbki przy długości fali 412nm wcześniej zerując spektrofotometr względem odnośnika.

c)    Oznaczanie „dostępnych" grup SH w białku

S Do probówki „odnośnik" dodaliśmy 2ml roztworu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5

S Do 2 probówek podpisanych „próbka" dodaliśmy po lml rozcieńczonego roztworu białka oraz po lml roztworu (lOmM Tris-HCI, 2mM EDTA) o pH 7.5