87759

(siarczan miedzi jest dodawany do alkalicznego roztworu białka -> kolor purpurowo-fioletowy)

2) redukcja reagenta Folin-Ciocalteu (fosfomolibdenian i fosfowolramian) -> niebieski kolor z max absorbancji przy 750 nm

•    barwa zależna nie tylko od kompleksu (zredukowana miedź-wiązanie amidowe), ale też od reszt tyrozyny, tryptofanu, cystyny, cysteiny i histydyny.

•    mierzy się absorbancję przy 750 nm

•    wrażliwa na różne związki towarzyszące

Metoda BCA - kwas bicynchoninowy:

•    zastąpienie odczynnika Folin-Ciocalteu kwasem bicynchoninowym -> zwiększenie wrażliwości i tolerancji na związki przeszkadzające

•    tworzy się fioletowy kompleks z jonami Cu+ (powstały z Cu2+ i białek)

•    reakcja zależna od temperatury

•    inkubacja w 37 lub 60*C

•    mierzy się absorbancję przy 562 nm

•    wrażliwe na chelatory miedzi (np. EDTA) i reduktory Cu2+ (np. DTT)

Ćwiczenie 5 i 6:

1.    Reakcje chlorku dansylu:

Chlorek dansylu jest reaktywny względem różnych zasad. W analizie sekwencyjnej najważniejsze są aminy pierwszo- i drugorzędowe obecne jako końcowe grupy aminowe peptydów i białek. Reaktywne łańcuchy boczne zawierają (uporządkowane według malejącej reaktywności):

•    tiol (cysteina).

•    fenolohydroksyl (tyrozyna).

•    amina (lizyna),

•    imidazol (histydyna)

Chlorek dansylu jest raczej wrażliwy na hydrolizę przez wodę i jony hydroksylowe. Grupy aminowe reagują tylko jako wolna zasada (R-NH2). a nie jako sprzężony kwas (R-NH3+). więc oznaczanie musi odbywać się wpH alkalicznym.

2.    Identyfikacja dansylowanych aminokwasów:

•    do analizy DNS-aminokwasów używa się elektroforezy wysokonapięciowej oraz chromatografii na warstwach poliamidowych.

•    mieszaninę DNS-aminokwasów tworzy się z: aminokwasy + NaHC03 + DNS-CI w acetonie (po zakończonej reakcji dodaje się kwasu mrówkowego i w tym przechowuje)

•    wysokonapięciowa elektroforeza w pH 4,4: najlepiej najpierw wyekstrahować DNS-aminokwasy z hydrolizatu (octanem etylu z wodą) -> usunięcie HCI

•    w hydrolizacie znajduje się głównie chlorek sodu i DNS-OH, a oprócz tego aminokwasy, DNS-aminokwasy oraz DNS-NH2.

•    suchy octan etylu nie penetruje soli na tyle wydajnie, żeby wyekstrahować DNS-aminokwasy; górna faza mieszaniny octan etylu/woda jest na tyle mokra, żeby przekształcić sól w cienką warstwę roztworu, z której DNS-aminokwasy łatwo ekstrahują.

3.    Wizualizacja DNS-pochodnych: