1105140380

Grzegorz Machnik, Krzysztof Rurański, Paweł Sorek, Katarzyna Jadayk, Krzysztof Łabuzek, Bogusław Okopień

sja w tychże tkankach jest niezaprzeczalna i nadal poddawana obserwacjom przez wielu naukowców.

W 2001 roku, grupa badawcza pod kierownictwem Fenga Wang-Johanninga poszukiwała antygenów obecnych specyficznie w komórkach raka piersi, mogących stać się potencjalnymi markerami nowotworowymi czy też nawet celem terapii immunologicznej [46]. W swych poszukiwaniach badali oni także ekspresję endogennych retrowirusów, które pojawiały się już w doniesieniach innych naukowców, jako biorące udział w rozwoju wielu ludzkich nowotworów. Były to wirusy ERV-3, HERV-E4-1 oraz wymieniany już wcześniej w tym kontekście HERV-K [46].

W pierwszej części badania, za pomocą reakcji RT-PCR poszukiwano ekspresji genu env wspomnianych wirusów zarówno w liniach komórkowych jak i próbkach chirurgicznych usuniętych z raka piersi oraz prawidłowych tkanek [46]. Startery zostały tak skonstruowane, by umożliwiły wykrycie transkryptów kodujących powierzchniowy fragment potencjalnego białka Env. Dodatnią ekspresję env HERV-K wykryto w większości linii komórek rakowych oraz niemal połowie fragmentów raka piersi, uzyskując jednocześnie wynik ujemny we wszystkich próbkach prawidłowych komórek piersi. W żadnej z próbek nie udało się natomiast zaobserwować ekspresji HERV-E4-1 ani ERV-3. Wyniki potwierdzono przy zastosowaniu techniki Northern-Blot oraz hybrydyzacji in situ (1SH) otrzymując podobne rezultaty [46].

W celu odpowiedzi na pytanie, czy wykryte transkrypty nie są obciążone żadną mutacją uniemożliwiającą prawidłowe syntetyzowanie wirusowego białka, sklonowano wyizolowane z próbek raka piersi cDNA i przeprowadzono ekspresję białka w warunkach in vitro [46]. Cztery z sześciu klonów kodowały białko o przewidzianym wcześniej rozmiarze molekularnym. Wyniki te sugerują, że wykryte transkrypty genu env HERV-K nie zawierają istotnych mutacji i stanowią pośredni dowód na możliwość stabilnej ekspresji białka Env HERV-K [46].

Mimo dowodów na istnienie ekspresji genu env HERV-K, przez dłuższy czas naukowcy nie potwierdzali obecności produkcji wirusowego białka w ludzkich komórkach raka piersi. W 2002 roku pojawiła się publikacja opisująca swoistą dla HERV-K odpowiedź immunologiczną ze strony limfocytów Tc u chorych na czerniaka złośliwego [ 19]. Odpowiedź na pytanie czy analogiczna sytuacja zachodzi w przypadku raka piersi pojawiła się dopiero w 2008 roku, w którym to grupa badawcza Wang-Johanning i wsp. już wcześniej zajmująca się problematyką HERV-K dokonała znamiennego odkrycia [47].

Za pomocą metod inżynierii genetycznej cytowani autorzy otrzymali monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko powierzchniowej domenie białka Env HERV-K (K-SU), które następnie posłużyły do wykrycia ekspresji białka Env w próbkach i liniach komórkowych raka piersi. Test immunohistoche-mii przy użyciu przeciwciała o największej swoistości dał wynik dodatni w 85,7% próbek inwazyjnego raka przewodowego piersi. Tylko niewielka ekspresja białka została wykryta w próbkach prawidłowej tkanki piersi (7,14%) [47]. Ekspresja białka Env była zatem znamiennie statystycznie wyższa w próbkach raka w stosunku do próbek prawidłowych. Silną ekspresję wykryto również w próbkach raka śródprzewodowego (DCIS) oraz w przerzutach raka do węzłów chłonnych. W kolejnym etapie.

naukowcom udało się wykryć swoiste dla białka Env HERV-K przeciwciała w surowicy pacjentek chorych na raka piersi. Wykazano obecność przeciwciał skierowanych nie tylko przeciwko białku Env o pełnej długości (K-Env), ale też przeciw domenie powierzchniowej Env (K-SU). Ilość przeciwciał anty-K-SU była większa niż przeciwciał anty-K-Env, co sugeruje, że głównie fragment powierzchniowy białka Env jest uwalniany do układu krążenia wyzwalając odpowiedź komórek B. Przeciwciała anty-K-SU wykryto w surowicy około 50% pacjentek chorych na raka, a ich miano było znamiennie wyższe niż u pacjentek zdrowych [47].

W dalszej kolejności udowodniono także, że wyizolowane z surowic kobiet chorych na raka piersi limfocyty T cytotok-syczne (Tc-BC) po specyficznej stymulacji antygenami HERV-K wykazują wyższy stopień proliferacji w porównaniu do limfocytów pobranych od osób zdrowych. Limfocyty Tc-BC przejawiały również znaczną aktywność cytolityczną w stosunku do komórek eksponujących antygen K-SU po stymulacji in vitro w porównaniu z próbą kontrolną [47].

Powyższe badanie nie tylko wykazało istnienie zjawiska syntezy białka wirusowego HERV-K u pacjentek chorych na raka piersi, lecz także udowodniło jego zdolność do indukowania specyficznej odpowiedzi układu immunologicznego, zarówno humoralnej jak i komórkowej. Ta swoista odpowiedź organizmu na antygeny syntetyzowane wybiórczo w komórkach nowotworowych może stanowić podstawę do praktycznego zastosowania tej wiedzy.

Zjawisko pobudzania reakcji układu odpornościowego u chorych na raka piersi przez antygeny HERV-K może być wykorzystane w celach prognostycznych. Problem został poruszony w 2009 roku przez Zhao i wsp. Analiza związku pomiędzy ekspresją białka Env a kliniczną charakterystyką zaawansowania choroby istotnie wykazała liczne korelacje [48]. Ekspresja Env HERV-K była dodatnio skorelowana ze średnicą guza, a także ze stadium klinicznego zaawansowania choroby (clinical stage) oraz liczbą zajętych węzłów chłonnych. Jednocześnie silna ekspresja Env związana była ze znamiennie niższym ogólnym wskaźnikiem przeżycia niż w przypadku średniej lub słabej ekspresji Env. Nie znaleziono natomiast związku z wiekiem, ekspresją receptorów ER/PR ani stopniem histologicznego zaawansowania nowotworu. Analogiczne badanie przeprowadzone na innej grupie pacjentek dało zbliżone wyniki [48].

Wydaje się zatem, że ocena ekspresji Env HERV-K może być przydatna w diagnostyce raka piersi oraz w prognozowaniu przebiegu choroby, obok parametrów wchodzących obecnie w skład klasyfikacji TNM (stopień zaawansowania klinicznego nowotworu). Wykazanie ekspresji białka Env HERV-K u chorych na raka piersi przy jednoczesnym braku tejże ekspresji u osób zdrowych sugeruje, że HERV-K ulega reaktywacji we wczesnym stadium karcynogenezy. Mogą stać za tym zmiany epigenetyczne zachodzące podczas rozwoju nowotworu, takie jak demetylacja uprzednio nieaktywnego wskutek metylacji genomu wirusa, a być może synteza białka wirusowego zachodzi w odpowiedzi na stymulację hormonalną, o czym donoszą dane z literatury [49, 50]. Powyższe badanie nie wykazało jednak związku ekspresji białka Env z obecnością receptorów ER/PR na komórkach nowotworowych. Dodatnia korelacja ekspresji Env ze stadium klinicznego

350