Tom 51, 2002
Numer 3 (256)
Strony 231 240
MIROSŁAWA WŁODARCZYK
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Uniwersytet Warszawski
Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa
e-mail: [e-mail]
CO TO JEST PLAZMID?
U organizmów prokariotycznych (bakterii i wiednika jądra (nukleus) eukariotycznego.
archeonów) podstawowa informacja gene- Oprócz chromosomu, w bardzo wielu komór-
tyczna zawarta jest zazwyczaj w jednej, dwuni- kach bakteryjnych występują dodatkowe ele-
ciowej koliS
cie zamkniętej cząsteczce DNA sta- menty genetyczne  plazmidy. Plazmidy nie są
nowiącej tzw. chromosom. WielkoS
ć chromo- niezbędne do życia komórki, gdyż wszystkie
somu prokariotycznego mierzona liczbą tysię- geny metabolizmu podstawowego (ang. house
cy par zasad (kb) zawiera się w przedziale od keeping genes) zlokalizowane są w chromoso-
niespełna 600 do blisko 10000 kb. U Escheri- mie, tym niemniej posiadanie plazmidów
chia coli, modelowego organizmu w bada- znacznie zwiększa zasób informacji genetycz-
niach genetycznych bakterii, wartoS
ć ta wyno- nej gospodarza. Wielka różnorodnoS
ć puli ge-
si 4 700 kb, co odpowiada długoS
ci 1400 m. nów zlokalizowanych na plazmidach odgrywa
W komórce chromosom jest upakowany w znaczącą rolę w zdolnoS
ciach adaptacyjnych
zwartą, lecz nieobłonioną strukturę okreS
laną prokariotów i w ich ewolucji.
mianem nukleoidu, funkcjonalnego odpo-
DEFINICJA
Plazmidy są to autonomiczne, pozachromo- komórki (tzw. wyleczenie, ang. curing) nie jest
somowe elementy genetyczne występujące letalne dla komórki gospodarza.
(zwykle w postaci kolistych lub rzadziej linio- Można też sformułować bardziej lakonicz-
wych cząsteczek DNA) u bardzo wielu organi- na definicję:  Plazmidy są to samodzielne poza-
zmów prokariotycznych oraz u niektórych eu- chromosomowe replikony .
kariotów. Ich najbardziej charakterystyczną Termin  plazmid został po raz pierwszy
cechą jest fizyczna odrębnoS
ć od chromosomu oficjalnie zaproponowany przez profesora Jos-
gospodarza oraz zdolnoS
ć do trwałego utrzy- hua Lederberga, pioniera badań genetycznych
mywania się (ang. maintenance) w komórce i bakterii, w 1952 r. jako generyczna nazwa
replikowania się w niej w kontrolowany spo- wszystkich znanych w tym czasie  pozachro-
sób. mosomowych cząstek genetycznych (LEDER-
Czasem definicja plazmidu uzupełniana BERG 1952). Wbrew pozornej zgodnoS
ci z
jest stwierdzeniem, że plazmid nie koduje podaną powyżej współczesną definicją, zna-
funkcji, które byłyby niezbędne do życia ko- czenie terminu plazmid sformułowane przez
mórki (w  normalnych warunkach). Konse- Lederberga było znacznie szersze, gdyż obej-
kwencją tego jest fakt, że usunięcie plazmidu z mowało tak różne  cząstki genetyczne jak pa-
232 MIROSŁAWA WŁODARCZYK
sożyty, symbionty, organelle, wirusy, episomy badań nad plazmidami, które już w 1978 r. za-
itp. i miało na celu zasygnalizowanie, że jądro owocowały powstaniem wysoce specjalistycz-
komórkowe nie jest wyłącznym  magazynem nego czasopisma  Plasmid , a w ostatniej deka-
informacji genetycznej, może ona bowiem być dzie publikowaniem rocznie około 3000 prac
w różnej formie zlokalizowana także w cyto- dotyczących problematyki plazmidowej,
plazmie. W obecnym znaczeniu termin pla- przedstawił Lederberg w rocznicowym (45 lat
zmid zaczął być używany niemal 10 lat póx
niej. od użycia terminu  plasmid ) artykule
Pewne swe przemyS
lenia dotyczące postępu (LEDERBERG 1997).
ODKRYCIE I POCZĄTEK BIOLOGII PLAZMIDÓW
Pierwszym czynnikiem genetycznym speł- 70. zidentyfikowano pierwsze plazmidy kata-
niającym kryteria współczesnej definicji pla- boliczne (TOL, CAM, OCT itp.). Wczesne lata
zmidów był tzw. faktor F. Odkryty został on na 70. to także okres, w którym z wykorzystaniem
przełomie lat 40. i 50. ubiegłego wieku. pod- naturalnych plazmidów, wykonano pionier-
czas badań nad rekombinacją u Escherichia skie eksperymenty będące podstawą rozwoju
coli K12. Nazwa faktor F pochodzi od angiel- techniki zwanej inżynierią genetyczną. Pierw-
skiego terminu Fertility  płodnoS
ć, gdyż po- szym takim eksperymentem, przeprowadzo-
siadanie przez komórkę takiego faktora warun- nym w Stanford University przez grupę ba-
kowało jej płodnoS
ć, rozumianą jako zdolnoS
ć dawczą Stanleya Cohena, było wstawienie frag-
do jednokierunkowego przekazywania mate- mentu genu kodującego opornoS
ć na kanamy-
riału genetycznego podczas bezpoS
redniego cynę do małego plazmidu pSC101 niosącego
kontaktu z inną komórką. O istnieniu czynnika cechę opornoS
ci na tetracyklinę (COHEN i
płodnoS
ci wnioskowano wtedy wyłącznie na współaut. 1973).
podstawie eksperymentów z zakresu klasycz- Od tego czasu badania nad plazmidami po-
nej analizy genetycznej. To, że czynnik F zbu- toczyły się dwiema drogami. Pierwsza to tzw.
dowany jest z DNA i występuje w formie wol- biologia plazmidów, a więc obszar badań, w
nej w cytoplazmie komórki wykazano 10 lat którym plazmid jako taki stanowi przedmiot
póx
niej. Wykorzystano tu metodę ultrawirowa- badań; analizowana jest struktura cząsteczki,
nia w gradiencie gęstoS
ci chlorku cezu wszelkie mechanizmy stanowiące o jego stabil-
(MARMUR i współaut. 1961), która ujawniła po- nym utrzymywaniu się w populacji bakterii
jawianie się w Serratia marcescens (której (ang. maintenance functions), analiza funkcji
chromosom zawiera 58% par GC), po koniuga- fenotypowych kodowanych przez geny obec-
cji z E. coli (F+), dodatkowej frakcji DNA o za- ne w naturalnych plazmidach, mechanizmy
wartoS
ci par GC = 50%, czyli charakterystycz- przekazywania plazmidów w obrębie gatunku
nej dla DNA E. coli. Faktem, który zainicjował oraz między gatunkami bakterii, znaczenie
postęp badań nad plazmidami i przeniósł je z tego procesu w ogólnie ujmowanym procesie
poziomu analizy pewnego rodzaju ciekawostki horyzontalnego transferu genów, ewolucja
naukowej do sfery badań mających bezpoS
red- plazmidów itp. Typowym przykładem potrak-
nie znaczenie dla zdrowia człowieka, było od- towania plazmidu jako fascynującego obiektu
krycie, że czynniki genetyczne odpowiedzial- biologicznego może być książka Davida
ne za gwałtowne rozprzestrzenianie się tzw. Summersa, w której nie pada ani razu termin
wielorakiej opornoS
ci na antybiotyki w czasie  wektor (SUMMERS 1996). Drugi sposób spoj-
epidemii czerwonki w Japonii w końcu lat 50. rzenia na plazmidy to spojrzenie czysto instru-
ubiegłego wieku wykazują, istotne podobie- mentalne  plazmid jako doskonałe narzędzie
ństwa do czynnika F. Pierwszym opisanym pla- inżynierii genetycznej, czyli zespołu nowocze-
zmidem z grupy plazmidów opornoS
ciowych snych technik biologii molekularnej umożli-
 R (ang. Resistance), był plazmid NR1 (znany wiających przeprowadzanie rekombinacji ge-
także jako R100 i R222) izolowany z Shigella netycznej genami in vitro (lub jak okreS
lają to
flexneri strain 222/CTS, warunkujący opor- niektórzy: celowe manipulowanie genami in
noS
ć na chloramfenikol, tetracyklinę i strepto- vitro). Cząsteczki plazmidów stały się istotnie
mycynę (MITSUHASHI i współaut. 1960). Obec- podstawą konstrukcji doskonałych i różnorod-
nie, plazmidy typu R są najliczniejszą grupą nych wektorów do klonowania genów, jest to
spoS
ród wszystkich opisanych. Na początku lat prawda niepodważalna, lecz niewątpliwie na-
Co to jest plazmid? 233
tura nie  stworzyła plazmidów z takim za- nia obu zasygnalizowanych aspektów badań
mysłem. W przedstawianym czytelnikom opra- nad plazmidami.
cowaniu podejmujemy próbę zaprezentowa-
STRUKTURA CZĄSTECZKI PLAZMIDOWEJ
WiększoS
ć plazmidów to koliste cząsteczki stępujący na przykład u Streptomyces, jest to
dwuniciowego DNA tworzące strukturę tzw.  prawdziwa liniowa cząsteczka dwuniciowe-
CCC-DNA (ang. covalently closed circle), która go DNA (posiadająca wolne końce), której
wykazuje negatywne superskręcenie (wyjąt- cechą charakterystyczna jest obecnoS
ć białek
kiem są plazmidy izolowane z hypertermofil- terminalych (TP) połączonych z końcem 5 -
nych Archaea, u których udokumentowano po- łańcucha DNA (Ryc. 1B). Białka te chronią DNA
zytywne superskręcenie cząsteczek DNA pla- przed atakiem komórkowych 5 -egzonukleaz, a
zmidowego, co jak się wydaje jest jednym z ele- czasem, podobnie jak u adenowirusów, mogą
mentów ich przystosowania do funkcjonowa- pełnić rolę startera w replikacji cząsteczki
nia w temperaturach powyżej 100 C). Przez DNA. Wszystkie plazmidy tej grupy posiadają
wiele lat sądzono, że wszystkie plazmidy bakte- także długie terminalne powtórzenia. Drugi
ryjne występują w formie CCC-DNA (Ryc. 1A), typ, zwany typem  szpilki do włosów (ang. ha-
co powodowało, że ta cecha struktury cząstecz- irpin loop) to cząsteczki widoczne w mikro-
skopie elektronowym jako struktury liniowe,
lecz których końce są kowalencyjnie połączo-
ne. Przykładem może być 16 kb liniowy pla-
zmid z Borrelia burgdorferi (HINNEBUSCH i
A
BARBOUR 1991). Plazmid ten to jeden polinu-
kleotydowy łańcuch, który jest komplementar-
ny na całej swej długoS
ci, z wyjątkiem krótkich
TP
ori
naprzeciwległych odcinków, w wyniku czego
3
B
3
powstają jednoniciowe pętle (Ryc. 1C)) na ko-
TP
ńcach płaskiej liniowej dwuniciowej struktury
(stąd nazwa  hairpin loop ). Taki plazmid po
C
denaturacji tworzy jedną jednoniciową kolistą
cząsteczkę.
W literaturze spotykany jest czasem termin
Ryc. 1. Formy strukturalne naturalnych plazmi-
 plazmidy jednoniciowe . Należy wyjaS
nić, że
dów bakteryjnych.
plazmidy jednoniciowe, to nie jest kolejna na-
A  Plazmid kolisty w formie CCC-DNA (kowalentnie
turalna forma strukturalna plazmidów. Termin
zamkniętego koła). B  Plazmid liniowy; TP  białka
ten odnosi się do poS
redniej formy replikacyj-
terminalne, ori  punkt startu replikacji. C Plazmid
liniowy typu  hairpin loop
nej występującej w szlaku replikacyjnym pla-
zmidów bakterii Gram-dodatnich repli-
kujących się według mechanizmu  toczącego
ki plazmidu była (i czasem wciąż jest) umiesz- się koła (ang. roling circle replication, RCR).
Przy pewnych zaburzeniach procesu replikacji
czana w jego definicji. Takiemu poglądowi
może następować nagromadzanie się tych jed-
sprzyjało powszechne stosowanie do izolacji i
noniciowych kolistych form w komórce do ilo-
oczyszczania plazmidów metod preferujących
tę formę strukturalną DNA (patrz następny roz- S
ci wykrywalnej metodami fizykochemiczny-
dział). Nie wszystkie jednak plazmidy są koli- mi. Z kolei, widoczne czasem w preparatach
mikroskopii elektronowej lub w obrazach
ste, pierwsze liniowe plazmidy wykryto na
początku lat 80. u drożdży Kluyveromyces lac- elektroforetycznych, formy OC i liniowe towa-
tis, a wkrótce także u bakterii, np. u przedstawi- rzyszące klasycznej postaci CCC-DNA, są naj-
cieli rodzajów Streptomyces, Borrelia, Nocar- częS
ciej wynikiem przekształceń formy CCC w
wyniku zerwania (pęknięcia) jednego lub
dia, Rhodococcus (MEINHARDT i współaut.
1997). WS
ród plazmidów liniowych wyróżnia- dwóch naprzeciwległych wiązań fosfodwu-
my dwa typy strukturalne. Pierwszy z nich, wy- estrowych w cząsteczce kolistej.
234 MIROSŁAWA WŁODARCZYK
WIELKOR
Ć
WielkoS
ć plazmidów jest bardzo zróżnico- plazmidu może przekraczać nawet wielkoS
ć
wana i zawiera się w granicach od około 1000 chromosomów niektórych bakterii (np. chro-
par zasad (1 kb) do nawet około 1700 kb. Naj- mosom Mycoplasma genitalium ma 580 kb,
mniejsze plazmidy, o wielkoS
ci nieznacznie Helicobacter pylori 1600 kb). Sama tylko wiel-
przekraczającej 1 kb, zidentyfikowano w He- koS
ć cząsteczki DNA nie może więc być para-
amophilus somnus, Mycoplasma sp. i Helico- metrem rozróżniającym pomiędzy plazmidem
bacter pylori (kompletne sekwencje tych pla- a chromosomem. Z reguły duże plazmidy to te,
zmidów znajdują się w bazie danych NCBI). Z które niosą geny warunkujące złożone procesy
kolei plazmidy o górnej granicy podanej wiel- fizjologiczne (np. zdolnoS
ć do koniugacji),
koS
ci, zwane megaplazmidami, zostały zidenty- skomplikowane szlaki metaboliczne (plazmidy
fikowane wS
ród przedstawicieli Rhizobium i kataboliczne, np. pWW0) lub opornoS
ć na kil-
są to często plazmidy odpowiedzialne za pro- ka antybiotyków i innych substancji antybakte-
ces symbiotycznego wiązania azotu (pSym) ryjnych (np. plazmid NR1, RK2). Znając wiel-
przez gospodarza (BANFALVI i współaut. 1981). koS
ć plazmidu łatwo jest w przybliżeniu osza-
Wielu badaczy mianem megaplazmidów okre- cować ile S
redniej wielkoS
ci białek może być
S
la także plazmidy o wielkoS
ci poniżej 1 Mb kodowanych przez jego genom, czyli okreS
lić
(1000 kb), nawet już plazmidy o wielkoS
ci 150 tzw. teoretyczną pojemnoS
ć kodującą plazmi-
 200 kb (0,15 0,2 Mb), czyli po prostu bardzo du (przyjmujemy, że gen kodujący S
redniej
duże. wielkoS
ci białko, 30 kDa, zajmuje 1 kb). Takie
Dolna wartoS
ć wielkoS
ci plazmidu wyzna- szacunki dają nam wyobrażenie jaki procent
czana jest minimalną iloS
cią informacji gene- całkowitej, niesionej przez komórkę informa-
tycznej potrzebnej do kodowania funkcji abso- cji genetycznej,  przypada na informację nie-
lutnie niezbędnych do jego powielenia (repli- sioną przez plazmid. WartoS
ć ta dla modelowe-
kacji), nie pozostawiając praktycznie miejsca go układu: komórka E. coli niosąca plazmid F
na kodowanie żadnych dodatkowych cech fe- (czyli szczep F+) wynosi 2%, ale może osiągać
notypowych. W takiej sytuacji mielibyS
my do wartoS
ci nawet do kilkudziesięciu procent w
czynienia z tzw.  prawdziwym plazmidem przypadku bardzo dużych lub wielokopio-
kryptycznym. Z kolei górna granica wielkoS
ci wych plazmidów.
NAZEWNICTWO
Zanim opracowano metody wykazywania cyn przez Escherichia coli to grupa plazmidów
fizycznej obecnoS
ci DNA plazmidowego w ko- Col (ColE1, ColIb, ColV itd.). W miarę lawino-
mórkach (patrz następny rozdział), o obecno- wego zwiększania się liczby nowoodkrywa-
S
ci plazmidów wnioskowano na podstawie nych (a potem także konstruowanych in vi-
cech fenotypowych, jakie ich obecnoS
ć nada- tro) plazmidów, tego typu nazewnictwo stało
wała komórkom gospodarza. Konsekwencją się mało przejrzyste i wprowadzające szereg
tego było nazywanie plazmidów w oparciu o nieporozumień. W związku z tym zapropono-
te właS
nie cechy. I tak, jak już wspomniałam, wano standaryzację nazewnictwa plazmidów,
nazwa plazmidu F pochodzi od cechy płodno- której zasady opublikowano w 1976 r.
S
ci (ang. fertility), która zależy od jego obec- (NOVICK i współaut. 1976). Od tego czasu pla-
noS
ci w komórce E. coli. Plazmidy niosące zmidy winny być oznaczane symbolami i nu-
geny opornoS
ci na antybiotyki, to plazmidy R. merami, podobnie jak szczepy bakteryjne, a
Dla pierwszego z nich przyjęto nazwę NR1 wybrany symbol winien być poprzedzony
(pierwszy plazmid R opisano w National Insti- prefiksem  p  od plazmid. Zwykle symbole
tute of Health w Japonii), kolejne obok ozna- literowe pochodziły od nazwisk odkrywców. I
czenia R zyskiwały dodatkowo numery lub tak np. pBR322  plazmid skonstruowany
symbole literowe. Plazmidy degradacyjne (ka- przez Bolivara i Rodrigueza jako 322 plazmid
taboliczne) TOL, CAM, OCT itp. oznaczono w ich kolekcji, po wprowadzeniu do niego
symbolami informującymi jakie substancje są genu opornoS
ci na chloramfenikol zyskał
degradowane pod kontrolą tychże plazmidów oznaczenie pBR325. Znany powszechnie mały
(odpowiednio: TOLuen, CAMphor, OCTane). plazmid opornoS
ciowy z kolekcji Stanleya Co-
Plazmidy odpowiedzialne za produkcję koli- hena nosi nazwę pSC101, z kolei seria plazmi-
Co to jest plazmid? 235
dów pUB pochodzi z laboratorium University (PRC) funkcjonował przy Stanford Universi-
of Bristol. Te zasady nazewnictwa plazmidów ty, a był prowadzony przez żonę profesora Le-
zostały zaakceptowane i weszły do powszech- derberga  Esther Lederberg. Okresowo pu-
nego użycia, jednak wiele utrwalonych trady- blikowane były bieżące listy  Plasmid Prefix
cją nazw pozostało niezmienionych (F, ColE1, Designations Registered by PRC (LEDERBERG
RK2 itp.). Prawdopodobnie niewielu badaczy 1986). O ile wiem, zwyczaj rejestracji ozna-
(zwłaszcza młodych) zajmujących się plazmi- czeń plazmidów został jakiS
czas temu zarzu-
dami pamięta, że w 1977 r. założony został cony, dlatego przed użyciem wybranego
centralny oS
rodek rejestrujący i wydający cer- przez siebie oznaczenia plazmidu w oficjalnej
tyfikaty legalnoS
ci używania wybranych sym- publikacji warto sprawdzić w odpowiednich
boli plazmidów, po ustaleniu, że nie zostały bazach danych, czy nie powielamy użytego
one dotychczas wykorzystane przez inną oso- wczeS
niej symbolu, aby uniknąć mogących
bę. OS
rodek  The Plasmid Reference Center wyniknąć z tego nieporozumień.
KLASYFIKACJA
W miarę odkrywania coraz to większej licz- dów, które definiujemy jako niemożnoS
ć
by plazmidów i opisywania niezwykłej różno- współistnienia dwóch plazmidów w jednej li-
rodnoS
ci funkcji przez nie kodowanych poja- nii komórkowej, tę właS
nie cechę odzwiercie-
wiła się naturalna w biologii potrzeba opraco- dlającą stopień pokrewieństwa systemów re-
wania systemu ich klasyfikacji. Pierwsze syste- plikacyjnych plazmidów, przyjęto za podstawę
my klasyfikacji plazmidów oparte były o feno- klasyfikacji. Pionierskie próby takiej klasyfika-
typy komórek gospodarza, które zależały od cji podjęła Naomi Datta już we wczesnych la-
obecnoS
ci okreS
lonego plazmidu (lub grupy tach 70., a podsumowuje je praca z 1979 r.
plazmidów). Wyróżniono więc np. plazmidy (DATTA 1979). Wtedy system kwalifikowania
 koniugacyjne (plazmid F), warunkujące plazmidu do odpowiedniej grupy niezgodno-
opornoS
ć na antybiotyki (NR1, RK2), bakterio- S
ci (Inc) prowadzono metodami genetyki kla-
cynogenne (ColE1), degradacyjne (TOL), sym- sycznej, co było procedurą doS
ć żmudną. No-
biotyczne (pSYM) itd. Klasyfikacja taka, aczkol- woczesny, wprowadzony przed kilkunastu laty
wiek dla pewnych celów użyteczna, ma szereg system tzw. typowania replikowanego, oparty
niedogodnoS
ci, z których na pierwszym miej- na stwierdzaniu homologii (lub jej braku) mię-
scu należy podkreS
lić, że jest to klasyfikacja nie- dzy replikonami przy użyciu technik hybrydy-
wyklucząjąca (lub zachodząca), gdyż według zacji DNA, z wykorzystaniem odpowiednich
niej wiele plazmidów należałoby włączyć do specyficznych sond molekularnych reprezen-
dwóch lub nawet trzech grup (np. plazmidy R1 tujących różne grupy niezgodnoS
ci, pozwolił
czy RK2 to plazmidy opornoS
ciowe, ale także na znaczny postęp w klasyfikacji plazmidów.
koniugacyjne). Powstała próba opracowania Najpełniejszy system tego typu klasyfikacji, wy-
schematu klasyfikacji opartego o cechę, która różniający około 30 grup niezgodnoS
ci, stwo-
byłaby unikatowa dla każdej wyróżnionej gru- rzono dla plazmidów z Enterobacteriaceae
py. Po poznaniu zjawiska niezgodnoS
ci plazmi- (COUTURIER i współaut. 1988).
METODY IDENTYFIKACJI PLAZMIDÓW
Zwięzłe omówienie tego zagadnienia nie przypadku dążymy do udowodnienia korelacji
jest proste, a nie jest moją intencją przedsta- pomiędzy jakąS
konkretną właS
ciwoS
cią fizjo-
wianie przeglądu technik eksperymentalnych logiczną badanych bakterii a potencjalną obec-
do tego celu wykorzystywanych. Najogólniej noS
cią pozachromosomowego czynnika tę ce-
mówiąc, o obecnoS
ci plazmidu(ów) w komór- chę warunkującą. Klasyczny przykład (dzięki
ce bakteryjnej możemy wnioskować poS
red- któremu odkryto plazmid F, a także pierwsze
nio, na podstawie cechy fenotypowej gospoda- plazmidy opornoS
ciowe, R) to analiza kinetyki
rza zależnej od potencjalnej obecnoS
ci plazmi- rozprzestrzeniania się analizowanej cechy w
du lub na podstawie bezpoS
redniego wykaza- populacji komórek. Cechy o plazmidowej loka-
nia (metodami fizykochemicznymi) obecnoS
ci lizacji (przy założeniu, że mamy doczynienia z
DNA plazmidowego w komórce. W pierwszym plazmidem koniugacyjnym) będą rozprze-
236 MIROSŁAWA WŁODARCZYK
strzeniały się w populacji z częstoS
cią znacznie lizy komórek przy użyciu lizozymu i SDS-u przy
wyższą niż cechy, których determinanty gene- pH 12,5. W tym etapie następuje także frag-
tyczne zlokalizowane są w chromosomie. Inną mentacja i denaturacja DNA chromosomowe-
drogą jest poddanie hodowli komórek o intere- go, podczas gdy znacznie mniejsze cząsteczki
sującym nas fenotypie działaniu czynnika usu- DNA plazmidowego zachowują swą strukturę i
wającego plazmidy z komórki (ang. curing) i po zwirowaniu masy DNA chromosomowego i
poszukiwanie klonów, które utraciły badaną pozostałych elementów wielkocząsteczko-
cechę fenotypową. WS
ród mikrobiologów S
ro- wych mogą być odzyskane z supernatantu. Po-
dowiskowych popularna staje się metoda iden- wszechnie stosowana do celów identyfikacyj-
tyfikacji plazmidów zwana  izolacją egzo- nych jest wersja powyższej metody zwana po-
genną (SMALLA i współaut. 2000). Metoda ta tocznie  mini-lizą alkaliczną . Analizujemy wte-
jest cenna z tego powodu, że pozwala na wy- dy niewielką objętoS
ć hodowli (1,5 ml), a anali-
krywanie plazmidów w bakteriach pocho- zę lizatu, po wstępnym oczyszczeniu, prowa-
dzących z naturalnego S
rodowiska bez potrze- dzimy metodą elektroforezy w żelu agarozo-
by otrzymania ich hodowli; można ją więc sto- wym, która pozwala nam uwidocznić obecne
sować nawet w odniesieniu do tzw. bakterii w lizacie plazmidy, a także okreS
lić ich liczbę i
niehodowalnych (ang. unculturable). Ograni- przybliżoną wielkoS
ć (Ryc. 2). Głównym ogra-
czeniem metody egzogennej izolacji jest nato- niczeniem tej metody jest jej przydatnoS
ć do
miast możliwoS
ć wykrywania tylko plazmidów
zdolnych do transferu koniugacyjnego i
niosących przydatny do selekcji marker. Pole-
ga ona na przeprowadzeniu eksperymentu ko-
niugacji, w którym biorcą jest dobrze scharak-
teryzowany laboratoryjny szczep bakteryjny,
natomiast  dawca to próbka pobrana ze S
rodo-
wiska, w której mogą znajdować się różne bak-
terie, także takie, które niosą plazmid warun-
kujący cechę wykorzystywaną do selekcji tran-
skoniugantów. Jeżeli w wyniku takiego ekspe-
rymentu uzyskamy biorcę  wzbogaconego o
dodatkową, wybraną cechę fenotypową, to
mamy podstawę do wnioskowania, że
Ryc. 2 .Wyniki analizy elektroforetycznej w żelu
związana jest ona z nabyciem drogą koniugacji
agarozowym lizatów kilku szczepów bakterii
plazmidu pochodzącego z zewnątrz (stad na-
niosących plazmidy różnej wielkoS
ci
zwa techniki  egzogenna ), od bliżej nieokre-
S
lonego dawcy. Plazmid taki znajduje się teraz
identyfikacji jedynie niezbyt dużych plazmi-
w znanym nam gospodarzu, co umożliwia jego
dów kolistych (takich jednak jest większoS
ć).
dalszą analizę, otrzymanie w czystej postaci i
Duże plazmidy (ponad 100 kb) mogą nie być w
standardową charakterystykę (patrz następny
tych warunkach wykrywane, gdyż podczas
rozdział).
Wykrywanie plazmidów poprzez stwier- preparatyki ulegają łatwo mechanicznemu
dzenie fizycznej obecnoS
ci DNA plazmidowe- uszkodzeniu, a ich DNA przechodzi do frakcji
go w puli totalnego DNA komórkowego nastę- DNA liniowego. Identyfikacja dużych plazmi-
dów możliwa jest przy zastosowaniu metod, w
puje w kilku etapach, z których każdy może być
których liza komórek przeprowadzana jest bez-
realizowany wieloma sposobami. Pierwszy
etap to łagodna liza hodowli bakteryjnej w wy- poS
rednio w żelu agarozowym, co minimalizu-
je niekontrolowane uszkadzanie ich cząste-
niku której otrzymujemy tzw. surowy lizat, z
czek (ECKHARDT 1978) lub przy zastosowaniu
którego następnie usuwamy możliwie dużo
DNA chromosomowego, aby DNA plazmido- analizy elektoroforetycznej typu PFGE (ang.
pulsed field gel electrophoresis), przystosowa-
wy, stanowiący zwykle niewielki procent
całkowitego DNA był łatwiejszy do uwidocz- nej do analizy dużych cząsteczek DNA. Także
nienia. WiększoS
ć obecnie stosowanych me- plazmidy liniowe nie są w warunkach lizy alka-
licznej wykrywane, gdyż ulegają, podobnie jak
tod opiera się na klasycznej metodzie tzw. lizy
liniowe fragmenty chromosomu, nieodwracal-
alkalicznej (BIRNBOIM i DOLY 1979), w której
nej denaturacji. W przypadku plazmidów linio-
krytycznym momentem jest przeprowadzenie
Co to jest plazmid? 237
wych wymagane jest przeprowadzanie prepa- ruje gotowe zestawy do izolacji DNA plazmido-
ratyki w warunkach neutralnych (niedenatu- wego; zwykle opierają się one na klasycznej
rujących). metodzie lizy alkalicznej, lecz dzięki zastoso-
Opisana metoda pozwala identyfikować ta- waniu różnego typu ułatwień technicznych,
kże plazmidy kryptyczne, czyli takie, które nie znacznie upraszczają i przyspieszają procedu-
niosą innych, poza zdolnoS
cią do własnej repli- rę, a także dostarczają preparat DNA plazmido-
kacji, rozpoznanych cech fenotypowych. wego o wysokim stopniu czystoS
ci.
Obecnie wiele firm biotechnologicznych ofe-
PREPARATYWNA IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO I SCHEMAT STANDARDOWEJ
CHARAKTERYSTYKI PLAZMIDU
Techniki służące do wykrycia plazmidu w nas plazmidu. Szczególnie trudne jest otrzyma-
bakteriach poprzez wykazanie fizycznej obec- nie czystego preparatu DNA plazmidów linio-
noS
ci jego DNA w komórkach gospodarza wych; jedna z możliwoS
ci to reizolacja takiego
mogą być wykorzystane także do preparatyki plazmidu z odpowiedniego prążka DNA uwi-
DNA plazmidowego. Aby jednak preparat taki docznionego w żelu agarozowym po elektrofo-
charakteryzował się stopniem czystoS
ci odpo- rezie.
wiednim do przeprowadzania jego dalszej cha- Dysponując czystym preparatem DNA pla-
rakterystyki molekularnej, należy zastosować zmidowego możemy zaplanować zgodną z na-
procedury usuwające z preparatu pozostałoS
ci szymi potrzebami jego dalszą charakterystykę.
DNA chromosomowego, towarzyszące białka, Jest jednak kilka elementów charakterystyki,
RNA, potencjalne inhibitory reakcji enzyma-
tycznych itp. Techniką powszechnie stoso-
waną do otrzymywania dużych iloS
ci czystego
liniowe cząsteczki
DNA plazmidowego była przez lata procedura
DNA
ultrawirowania w gradiencie gęstoS
ci chlorku
OC DNA
cezu z bromkiem etydyny, w której separacja
DNA plazmidowego od chromosomowego CCC DNA
opiera się na zróżnicowanym stopniu inkorpo-
racji bromu etydyny (CsCl+EtBr) przez koliste
plazmidowe formy, formy OC i liniowe chro-
RNA
mosomowe (po celowej fragmentacji natyw-
nych chromosomów) cząsteczki DNA, co pro-
Przed wirowaniem Po wirowaniu
wadzi do zróżnicowania ich gęstoS
ci pławnej
umożliwiającej rozdział w gradiencie (Ryc. 3).
Ryc. 3. Oczyszczanie DNA plazmidowego metodą
Obecnie, opisana technika ultrawirowania
ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu z
jako doS
ć pracochłonna, długotrwała i droga,
bromkiem etydyny.
ustępuje w popularnoS
ci stosowania korzysta-
Próbka przed wirowaniem zawiera mieszaninę róż-
niu z licznych komercyjnych zestawów do
nych form DNA, resztki RNA i białek w roztworze
oczyszczania DNA.
CsCl+EtBr. Po wirowaniu (typowe warunki: 48 godz.,
Niezależnie od wybranej metody oczysz-
40 tys. obr/min) następuje rozdzielenie formy
czania DNA plazmidowego należy uwzględnić
CCC-DNA od pozostałych
fakt, że jeżeli chcemy otrzymać czysty preparat
DNA jednego tylko plazmidu musimy być pew-
ni, że materiał (klon bakterii) użyty do prepara-
których przeprowadzenie zalecane jest w stan-
tyki DNA zawiera tylko ten jeden plazmid. Gdy
dardowej analizie każdego plazmidu.
wstępna analiza (np. obraz elektoforetyczny li-
zatu) wskazuje na obecnoS
ć więcej niż jednego
plazmidu, należy każdy z nich (lub ten nas inte-
WIELKOR
Ć PLAZMIDU
resujący) przenieS
ć z naturalnego gospodarza
(odpowiednimi metodami, których omawia- OkreS
lić ją możemy poprzez: (i) porówna-
nie przekracza zakres tego opracowania) do nie tempa migracji w żelu agarozowym natural-
wybranego szczepu bezplazmidowego i taki nej formy badanego plazmidu z tempem migra-
klon użyć do preparatyki DNA interesującego cji wzorcowych plazmidów o znanej wielkoS
ci,
238 MIROSŁAWA WŁODARCZYK
(ii) zsumowanie wielkoS
ci liniowych fragmen- ment genomu plazmidowego o wielkoS
ci
tów restrykcyjnych otrzymanych po trawieniu około 3 kb. Zidentyfikowany minimalny repli-
DNA plazmidu jednym lub kilkoma enzymami kon jest doskonałym materiałem do analizy sys-
restrykcyjnymi, (iii) zmierzenie tzw. długoS
ci temu replikacyjnego plazmidu.
konturowej plazmidu z użyciem mikroskopii
elektronowej i przyrównanie do obecnej w
LICZBA KOPII
tym samym preparacie cząsteczki DNA o zna-
nej długoS
ci, (iv) zsekwencjonowanie całej
cząsteczki DNA plazmidu. Ostatnią metodą Każdy plazmid, w swoim naturalnym go-
uzyskujemy najdokładniejszy wynik, jednak spodarzu, występuje w okreS
lonej, charaktery-
niezbyt często kompletne sekwencjonowanie stycznej dla siebie liczbie kopii. Mówimy o pla-
jest uzasadnione na etapie wstępnej charakte- zmidach (a) jednokopiowych (np. plazmid F),
rystyki plazmidu. kiedy to na komórkę, a precyzyjnie mówiąc na
jeden ekwiwalent chromosomu przypada jed-
na cząsteczka plazmidu, (b) niskokopiowych,
ANALIZA RESTRYKCYJNA gdy liczba kopii plazmidu okreS
lana w analo-
giczny sposób wynosi 3 8 cząsteczek (np.
Przeprowadzając analizę restrykcyjną DNA
pSC101) lub (c) wysoko(wielo)kopiowych
plazmidowego z wykorzystaniem kilku enzy- (np. ColE1), dla którego typowa liczba kopii
mów restrykcyjnych możemy skonstruować
wynosi 15 20, lub R6K z liczbą kopii około 30.
mapę restrykcyjną, będącą unikatowym opi- Plazmid w innym gospodarzu może występo-
sem tegoż plazmidu. Mapa taka jest niezmier- wać w innej liczbie kopii, a ponadto w warun-
nie przydatna w planowaniu bardziej szcze- kach laboratoryjnych jesteS
my w stanie zabu-
gółowej analizy molekularnej plazmidu (np. w
rzać systemy regulujące replikację chromoso-
identyfikacji modułów strukturalnych i funk- mu i plazmidu doprowadzając do nagromadze-
cjonalnych).
nia się w komórce nawet kilkuset kopii plazmi-
du (np. amplifikacja plazmidów typu ColE1 po-
przez hodowanie gospodarza w obecnoS
ci
TYPOWANIE REPLIKONOWE
chloramfenikolu lub spektynomycyny). Celo-
wo zwiększana jest też  kopijnoS
ć niektórych
Dzięki wykorzystaniu techniki hybrydyza-
wektorów plazmidowych, co ma znaczenie
cji z charakterystycznymi dla różnych grup nie-
przy maksymalizacji odzyskania iloS
ci klono-
zgodnoS
ciowych znakowanymi sondami repli-
wanego w takim wektorze egzogennego DNA.
konowymi możemy potwierdzić lub wyklu-
Metod okreS
lania liczby kopii plazmidu w ko-
czyć przynależnoS
ć badanego plazmidu do
mórce jest wiele, ich opisywanie przekracza za-
okreS
lonej grupy niezgodnoS
ci (Inc), otrzy-
planowane ramy tego opracowania, zwracam
mując jednoczeS
nie cenne informacje do-
jedynie uwagę, że jest to ważna cecha charakte-
tyczące typu jego systemu replikacyjnego.
ryzująca każdy plazmid.
IDENTYFIKACJA MINIMALNEGO REPLIKONU
ZAKRES GOSPODARZA
Celem takiej analizy jest zidentyfikowanie
OkreS
lony plazmid charakteryzuje się typo-
najmniejszego fragmentu badanego plazmidu,
wym dla siebie zakresem gospodarza (ang. host
który niesie minimalną, lecz wystarczającą do
range). Plazmid o wąskim zakresie gospodarza
samodzielnej replikacji iloS
ć informacji gene-
może funkcjonować tylko w swoim natural-
tycznej. Po trawieniu DNA plazmidu enzy-
nym gospodarzu lub filogenetycznie bliskich
mem/enzymami restrykcyjnymi i ligacji z wy-
mu bakteriach. Na przykład plazmid ColE1 i se-
branym markerem selekcyjnym przeprowa-
ria plazmidów o analogicznym systemie repli-
dzamy transformację odpowiedniego gospo-
kacyjnym, w tym popularne wektory, np.
darza i selekcjonujemy klony oporne na wybra-
pBR3222 lub seria pUC, mogą replikować się
ny czynnik selekcyjny (THOMAS 1987). Z reguły
tylko w różnych szczepach Escherichia coli.
plazmidowy minimalny replikon (nawet po-
Inne plazmidy mogą funkcjonować w wielu
chodzący z dużego plazmidu) stanowi frag-
różnych, czasem bardzo odległych filogene-
Co to jest plazmid? 239
tycznie gatunkach i wtedy nazywamy je plazmi- sowanych odsyłam do monografii  Bacterial
dami o szerokim zakresie gospodarza. Conjugation (CLEWELL 1993).
(THOMAS 1989). Podstawy molekularne tego
procesu są złożone, nie do końca poznane i ich
NIEZGODNOR
Ć
dyskusja przekracza ramy tego rozdziału (zain-
teresowanych odsyłam do artykułu I. KO-
NIECZNEGO, w tym zeszycie KOSMOSU). Ogól- Problem wykorzystania zjawiska niezgod-
nie mówiąc problem zakresu gospodarza noS
ci (ang. incompatibility) w tak ważnym pro-
wiąże się z typem systemu replikacyjnego, a cesie jak nowoczesna klasyfikacja plazmidów, o
głównie ze stopniem jego uzależnienia od którym mówiono wczeS
niej, jednoznacznie
uczestniczących w replikacji lub jej regulacji wskazuje na ważnoS
ć tego zjawiska w biologii
czynników bakteryjnych i sposobami  komuni- plazmidów. Zaklasyfikowanie plazmidu do od-
kowania się systemu replikacyjnego plazmidu powiedniej grupy niezgodnoS
ci to ważny ele-
z aparatem replikacyjnym gospodarza. Dyspo- ment jego charakterystyki. Zjawisko to rzutuje
nując preparatem DNA plazmidowego na często spotykany obraz obecnoS
ci w jednej
możemy wprowadzając go (np. poprzez elek- komórce bakteryjnej więcej niż jednego rodza-
troporację) do różnych szczepów bakteryj- ju plazmidu. W skrajnych przypadkach wykaza-
nych i potwierdzając jego stabilne w nich funk- no w jednej komórce obecnoS
ć kilkunastu róż-
cjonowanie, okreS
lić zakres gospodarza. nych plazmidów, np. u Borrelia burgdorferi
(FRASER i współaut. 1997).
ZDOLNOR
Ć DO TRANSFERU KONIUGACYJNEGO
FUNKCJE KODOWANE PRZEZ PLAZMIDOWY DNA
Wiele plazmidów wykazuje zdolnoS
ć do
przekazywania swego DNA do komórek bez- Mimo, że wymieniony na ostatnim miejscu,
plazmidowych w drodze bezpoS
redniego z jest to temat niezwykle ważny i wzbudzający bar-
nimi kontaktu. Gdy plazmid niesie komplet ge- dzo duże zainteresowanie  plazmidologów , a
nów potrzebny do wytworzenia kontaktu z ko- chyba jeszcze większe ludzi spoza grona S
cisłych
mórką biorcy i przekazania do niej DNA, klasy- specjalistów. RóżnorodnoS
ć bakteryjnych cech
fikujemy go jako plazmid koniugacyjny (Tra+). fenotypowych zależnych od obecnoS
ci w ich ko-
Wyróżniamy też plazmidy, zwane mobilizowal- mórkach plazmidów jest zadziwiająca. Temato-
nymi (Tra Mob+), które transferu swego DNA wi temu poS
więcony jest kolejny artykuł M.
do komórki biorcy mogą dokonać jedynie przy WŁODARCZYK w tym numerze KOSMOSU, dlate-
współudziale dodatkowego plazmidu (tzw. go teraz nie będzie on rozwijany. WS
ród plazmi-
mobilizującego), gdyż nie dysponują własnym dowo kodowanych cech są takie, które wydają
mechanizmem prowadzącym do wytworzenia się mieć oczywiste korzystne znaczenie dla bak-
kontaktu komórek. OkreS
lenie zdolnoS
ci ko- terii niosących dany plazmid (możliwoS
ć wzro-
niugacyjnych plazmidu może być dokonane w stu w obecnoS
ci antybiotyków i różnych sub-
klasycznym eksperymencie genetycznym lub stancji toksycznych) oraz takie, których znacze-
poprzez odnalezienie w jego genomie sekwen- nie jest mniej oczywiste (produkcja bakteriocyn,
cji homologicznych z elementami innych syste- niektóre właS
ciwoS
ci związane z patogenno-
mów koniugacyjnych. I znów, nie podejmuję S
cią). Wiele cech bakterii kodowanych przez
w tym miejscu analizy mechanizmów procesu geny plazmidowe ma negatywne (znów S
wiet-
koniugacji bakteryjnej. Zwracam jednak uwa- nym przykładem jest zależna od plazmidów leko-
gę, że poza mało popularnym systemem koniu- opornoS
ć bakterii chorobotwórczych) lub pozy-
gacji z udziałem transpozonów koniugacyj- tywne (wykorzystanie bakterii niosących plazmi-
nych, zawsze elementem odpowiedzialnym za dy degradacyjne w bioremediacji)  przełożenie
proces koniugacji bakteryjnej jest obecny w na znaczenie dla człowieka  jest to jednym z ele-
komórce dawcy plazmid. Jest to prawdziwe za- mentów motywacji do lepszego poznania tej
równo w systemie z udziałem pilusów płcio- ogromnej przecież puli materiału genetycznego,
wych (np. modelowy układ E.coli/plazmid F), aby minimalizować niekorzystne oddziaływanie
jak i koniugacji tzw. feromonowej (spotykanej na nasze życie, a coraz doskonalej wykorzysty-
głównie u bakterii Gram-dodatnich). Zaintere- wać jej pozytywne aspekty.
240 MIROSŁAWA WŁODARCZYK
WHAT IS A PLASMID?
S U MMA R Y
The paper constitutes a general introduction to proper plasmid naming and classification are given.
the biology and application of bacterial plasmids. The The methods of plasmid identification in bacterial
current definition of a plasmid is given as well as his- cells and its isolation in the form of purified DNA
torical background of the discovery of plasmids and preparations are summarized, followed by the scheme
early plasmid research. Plasmid structure and size of a typical procedure for plasmid characterization.
range are presented. The rules recommended for
LITERATURA
BANFALVI Z., SAKANYAN V., KONEZ C., KISS A., DUSHA I., LEDERBERG J., 1952. Cell genetics and heredity symbio-
KONDOROSI A., 1981. Location of nodulation and sis. Physiol. Rev., 32, 403 430.
nitrogen fixation genes on a high molecular we- LEDERBERG J., 1997. Personal perspective. Plasmid
ight plasmid of Rhizobium meliloti. Mol. Gen. Ge- (1952 1997). Plasmid 39, 1 9.
net. 184, 318 325. MARMUR J., ROWND R., FALKOW S., BARON l..S.,
BIRNBOIM H. C., DOLY J., 1979. A rapid alkaline extrac- SCHILDKRAUT C., DOTY P., 1961. The nature of inter-
tion procedure for screening recombinant pla- generic episomal infection. Proc. Natl. Acad. Sci.
smid DNA. Nucl. Acid. Res. 7, 1513 1523. USA 47, 972 979.
CLEWELL D. B., 1993. Bacterial Conjugation. Plenum MEINHARDT F., SCHAFRATH R., LARSEN M., 1997. Microbial
Press, New York, London. linear plasmids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47,
COHEN S. N., CHANG A. C., BOYER H. W., HELLING R. B., 329 336.
1973. Construction of biologically functional pla- MITSUHASHI S., HARADA K., HASHIMOTO H., 1960. Multiple
smid in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, resistance of enteric bacteria and reansmission of
3240 3244. drug resistance to other strains by mixed cultiva-
COUTURIER M., BEX F., BEERGQUIST P. L., MASS W. K., 1988. tion. Japan. J. Exper. Med. 30, 179 184.
Identification and classification of bacterial pla- NOVICK R. P., CLOWES R. C., COHEN S. N., CURTIS III R.,
smids. Microbiol. Rev. 52, 375 395. DATTA N., FALKOW S. 1976. Uniform nomenclature
DATTA N., 1979. Plasmid classification: incompatibili- for bacterial plasmids: a proposal. Bacteriol. Rev.
ty grouping. [W:] Plasmid of Medical, Environ- 40, 168 189.
mental and Commercial Importance. TIMMIS K. N., SMALLA K., OSBORN M., WELLINGTON E.M.H., 2000. Isola-
PUHLER A. (red). Elseviers/North Holland Publis- tion and characterization of plasmids from bacte-
hing Co., Amsterdam, 3 12. ria. [W:] The Horizontal Gene Pool: Bacterial Pla-
ECKHARDT T., 1978. A rapid method for the identifica- smids and Gene Spread. THOMAS C.M. (red). Har-
tion of plasmid desoxyribonucleic acid in bacte- wood Academic Reading, UK, 207 248.
ria. Plasmid 1, 584 588. SUMMERS D., 1996. The Biology of Plasmids. Blackwell
FRASER C. M. i 25 współaut., 1997. Genomic sequence of Science.
a Lyme disease spirochaete Borrelia burgdorferi. THOMAS C. M., 1987. Plasmid replication. [W:] Pla-
Nature 390, 580 586. smids, a Practical Approach. HARDY K. G. (red).
HINNEBUSCH J., BARBOUR A. G., 1991. Linear plasmids of IRL Press. Oxford, Washington D.C., 7 36.
Borrelia burgdorferi have a telomeric structure THOMAS C. M., 1989. Promiscuous Plasmids of Gram-
and sequence similar to those of a eukaryotic vi- negative Bacteria. Academic Press.
rus. J. Bacterial. 173, 7233 7239.
LEDERBERG E. M., 1986. Prefix designations. Plasmid
prefix designations by the Plasmid Reference Cen-
ter 1977 1985. Plasmid 15, 57 92.