8719220265

g) techniki rozdziału

Skład mieszaniny aa, np. pochodzącej z hydrolizy peptydu, można określić za pomocą chromatografii lub elektroforezy.

•    Istotą chromatografii jest rozdział składników między fazą stacjonarną a ruchomą, spowodowany ich silniejszym wiązaniem się z jedną z tych faz. Istnieje kilka rodzajów chromatografii.

•    Chromatografia bibułowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdyż nie wymaga specjalnego sprzętu. Kroplę roztworu zawierającą aa nanosi się na pasek bibuły (stąd nazwa), który następnie umieszcza się w szczelnym naczyniu, tak iż koniec paska styka się z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wędruje wzdłuż paska, „wciągany” przez higroskopijną strukturę bibuły. Po przepływie rozpuszczalnika do końca pasek suszy się oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny - powstają w ten sposób purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwością chromatograficzną, zależy od jego względnej polarności - aa z R niepolarnymi i długimi wędrują na pasku dalej niż aa z R krótszymi lub polarnymi. Dla każdego aa można wyznaczyć jego względną ruchliwość (Rf), definiowaną jako stosunek odległości przebytej przez dany aa do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika.

•    Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli się na podziałową (partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjną (adsorption TLC = ATLC).

>    W PTLC wykorzystuje się rozdział składników mieszaniny pomiędzy fazę stacjonarną oraz ciekłą -ruchomą, które dodatkowo różnią się polarnością.

S W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, zaś rozpuszczalnik zawiera zarówno składniki polarne, jak i mało polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nośnikiem zmienia się skład rozpuszczalnika, gdyż jego bardziej polarne składniki wiążą się z polarnymi grupami hydroksylowymi celulozy - wskutek tego przesuwające się czoło rozpuszczalnika staje się stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC słabiej polarne składniki mieszaniny wędrują więc dalej od polarnych podobnej wielkości.

S W PTLC w fazie odwróconej polamość faz oraz szybkość wędrówki składników próby są odwrotne niż powyżej - faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoją polamość. Dlatego polarne składniki mieszaniny wędrują z czołem rozpuszczalnika, a mniej polarne pozostają z tyłu.

>    W ATLC wykorzystuje się adsorpcję składników próby na prażonym żelu krzemionkowym. Faza ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane składniki, współzawodniczące o miejsce wiązania na żelu -składniki słabiej związane wymywane są w pierwszej kolejności.

•    Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypełnionej ściśliwym złożem, w warunkach wykluczających stosowanie wysokich ciśnień; ogranicza to maksymalną szybkość przepływu rozpuszczalnika, a tym samym szybkość całego procesu chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej, wypełnionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi cząsteczkami nieściśliwego wymiennika jonowego, sita molekularnego lub złoża stosowanego w chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Bywa również określana jako wysokociśnieniowa, gdyż wartości używanych ciśnień osiągają wartości 5-10 tys. psi. Do jej zalet należy znaczne skrócenie czasu rozdziału, co ogranicza dyfuzję boczną i zapewnia lepszy rozdział składników próby. Rozdział aa metodą HPLC uwzględnia ich reakcję z odczynnikiem umożliwiających ich identyfikację i ocenę ilościową. Reakcję tą przeprowadza się albo przed (pre-column) albo po (post-column) właściwej chromatografii. Przy barwieniu post-column używa się znanej już ninhydryny, która tworzy barwne związki indygowe (pochłaniające promieniowanie z zakresu światła widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column używa się odczynnika określanego skrótem AQC, który wykazuje zdolność fluorescencji - aa identyfikuje się więc przez oświetlenie lampą UV.

•    Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) służy do rozdzielania mieszanin amfolitów, czyli cząsteczek, których wypadkowy ładunek zależy od pH otoczenia.

Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Próbki nanosi się na nośnik zwilżony buforem o odpowiednim pH i następnie umieszcza w polu elektrycznym. Wówczas kationy wędrują do katody, a aniony do anody, przy czym szybkość wędrówki składników zależy od ich ładunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy cząsteczkowej (odwrotnie proporcjonalnie). Po zakończeniu rozdziału produkty uwidacznia (wybarwia) się odpowiednim odczynnikiem.

>    Rozdział aa prowadzi się na bibule lub cienkowarstwowej płytce pokrytej sproszkowaną celulozą, a wybarwia roztworem ninhydryny.

>    Rozdział polipeptydów i białek prowadzi się na usieciowanym żelu poliakrylamidowym (PAG).

-11-