2906542614

124 K. KALETHA [6]

wanej do czasu zerowego szybkości początkowej nie jest możliwe. Aby otrzymana z pomiarów doświadczalnych szybkość reakcji stanowiła dobre przybliżenie szybkości początkowej, zgodnie z wspomnianymi wyżej założeniami, wymaga się aby stopień zaawansowania reakcji nie był zbyt duży. Wykazano (3), że przy stopniu zaawansowania reakcji odpowiadającemu 10% zużycia substratu, przyjęcie założenia: v = A [A]/t, gdzie A [A] = [A]₀ —[A]_t, obciąża wartość wyliczonej szybkości reakcji błędem ponad 5% -towym (Ryc. 2). Ponadto metoda ta zaprzepaszcza wiele dodatkowych informacji jakie uzyskać można badając przebieg reakcji w dalszych jej stadiach. Na fakt ten zwraca ostatnio uwagę wielu badaczy starając się podkreślić znaczenie dokonania analizy kinetycznej pełnego przebiegu badanej reakcji enzymatycznej.

Próby wykorzystania dla analizy kinetycznej całej krzywej przebiegu reakcji enzymatycznej idą zasadniczo w dwu kierunkach. Większość z nich bazuje na scałkowanej postaci równania szybkości reakcji, podczas gdy niektóre inne (4, 5, 6) opierają się na różniczkowej jego postaci. Sposoby wyznaczania parametrów kinetycznych wykorzystujące analizę pełnej krzywej przebiegu reakcji podzielić możemy na graficzne i rachunkowe. Te ostatnie wykorzystują najczęściej technikę komputerową i opierają się na różnych metodach rachunku numerycznego i statystyki.

II-l. Reakcje niehamowane przez nagromadzający się produkt

Pierwszymi, którzy wykorzystali scałkowaną postać równania Michae-lisa w celu wyznaczenia parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej byli Walker i Schmidt (7). Na przykładzie reakcji katalizowanej przez dezaminazę histydyny wykazali oni, że równanie

(II I)    Vt = [P] + KJn {[A]o/([A]₀ — [P])}

otrzymane w wyniku scałkowania w przedziale czasowym [t₀ — 0, t] równania (I.9.), w warunkach kiedy przebieg reakeji determinowany jest jedynie zużywaniem się substratu, może być użyte do wyznaczenia stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej bez potrzeby wyznaczania początkowych szybkości reakcji. Po przekształceniu równania (II.1.) do postaci:

(112)

widać, że równanie to w układzie współrzędnych: — In [A]₀/([A]₀ — ,    [P]

— [P])}    opisuje linię prostą przecinającą oś odciętych w punkcie

o wartości równej V i o nachyleniu do tej osi równym — 1/K_m (Ryc. 3). Wobec zależności: [A] + [P] — [A]₀, równanie (II.1.) zapisać możemy w innej, równoważnej postaci: