2906542788

146 M. WILK, A. B. WOJTCZAK 16]

jeden kompleks enzymatyczny. Wartości K_m dla poszczególnych 2-keto-kwasów zawarte są w zakresie 8—20 mM a V_max w granicach 1,2—2,1 nmola/min/mg białka. Utlenianie każdego 2-ketokwasu jest hamowane przez izowalerylo-CoA (Kj w zakresie 7—18 mM) i NADH (K_t w zakresie 33—52 m-M). Maksymalną aktywność kompleksu wobec kwasu 2-ketoizo-kapronowego uzyskano w obecności pirogronianu tiaminy (K_m = 0,35 m-M, Mg*⁺ (K_m = 4,2 m-M), CoA (K_m w zakresie 7—9 mM) i NAD (K_m w zakresie 100—126 mM). Wykazano, że wszystkie trzy rozgałęzione 2-ketokwasy w stężeniu powyżej 500 mM hamują aktywność kompleksu.

Oznaczenie składników kompleksu dehydrogenazy 2-ketokwasów rozgałęzionych potrzebne jest dla potwierdzenia, że jest to analogiczny kompleks jak kompleksy dehydrogenazy pirogronianowej i dehydrogenazy 2-ketoglutaranu. Ze względu na to, że zaburzenia w przemianie aminokwasów rozgałęzionych leżą u podstaw szeregu chorób metabolicznych, ważne jest również wyjaśnienie roli rozpuszczalnej dehydrogenazy rozgałęzionych 2-ketokwasów, którą znaleziono we frakcji supernatantu wątroby wołu (45, 47).

II-3. Karboksylacja propionylo-CoA

Karboksylaza propionylo-CoA z serca świni została po raz pierwszy otrzymana w krystalicznej formie w pracowni O c h o a (49) a jako ho-mogenny preparat białkowy z mitochondriów wątroby wołu (50). Karboksylaza jest enzymem biotynowym; na jedną cząsteczkę enzymu przypadają cztery grupy biotynowe (51, 52). Ciężar cząsteczkowy enzymu z serca świni wynosi 697 000 (49, 52). Karboksylaza propionylo-CoA jest enzymem wyłącznie mitochondrialnym, występującym w matriks (53—55). Badania enzymu otrzymanego z serca świni (51, 56—58) oraz enzymu z mitochondriów wątroby wołu (59, 60) przyczyniły się do wyjaśnienia mechanizmu karboksylacji propionylo-CoA.

Karboksylacja ta zachodzi w dwóch etapach:

— pierwszy etap to przyłączenie C0₂ i utworzenie karboksybiotyny przy

udziale ATP i kationu dwuwartościowego, którym może być Mg*⁺ lub

Mn^ł+,

E-biotyna + ATP+HCOJ ₌[E-biotyna-C0₂] + ADP + P, (1)

— drugi etap to transkarboksylacja związana z przeniesieniem grupy karboksylowej z kompleksu [E-biotyna-C0₂] na odpowiedni akceptor, którym w tym przypadku jest propionylo-CoA.

[E-biotyna-C0₂] +propionylo-CoA    metylomalonylo-CoA + E-biotyna (2)

W etapie pierwszym magnez potrzebny jest do utworzenia kompleksu MgATP*^-, który stanowi jeden z substratów reakcji (52, 61), podczas gdy powstający ADP jest inhibitorem karboksylacji (Kj = 5,72X10~⁴ M) (58).