3725451936

*    pomiar stężenia cytokin - stosuje się komercyjne testy ELISA, zawierające swoiste przeciwciała monoklonalne przeciwko danej cytokinie, np. 11-2, IFN-y (charakterystyczne dla odpowiedzi komórkowej), 11-4,11-6 (charakterystyczne dla odpowiedzi humoralnej), TNF-a (pobudzenie makrofagów). W chorobach o podłożu autoimmunologicznym czy alergicznym dochodzi do zaburzonego uwalniania cytokin. Brak jest jednak uniwersalnego zakresu norm dla poszczególnych cytokin i badania są wykonywane głównie w celach naukowych.

Studenci oglądają prospekty do oznaczania cytokin oraz oznaczanie cytokin metodą ELISA i oceną stężenia w komputerze.

*    testy cvtotoksvczne - wykorzystywane są do oceny bezpośredniej cytotoksyczności limfocytów T i NK oraz w mechanizmie ADCC (komórki cytotoksyczne musza posiadać receptor Fc). Komórki efektorowe inkubuje się z „celem” (inne limfocyty, komórki nowotworowe, przeszczepu, zakażone wirusem, komórki opłaszczone przeciwciałem - mechanizm ADCC). Po kilkugodzinnej inkubacji (ok. 4 godz. dla limfocytów, 18-48 godz. dla makrofagów) dodaje się barwnika, np. eozyny czy błękitu trypanu, który wnika do martwych komórek - liczy się odsetek martwych komórek pod mikroskopem. Ocenę martwych komórek można ocenić stosując chrom 51 i mierząc radioaktywność.

Studenci oglądają testy limfocytoloksyczne w układzie: komórki Tc zabijające komórki białaczki limfatycznej L-1210 (na płytkach Terasaki).

Cytometria przepływowa - wykorzystuje się aparat o nazwie FACS (aktywowany fluorescencyjnie sorter komórek - fluorescence-activated celi sorter). Stosując laser argonowy o długości fali 488 nm jako źródło światła oraz detektor rozpraszania światła i detektor fluorescencji, analizuje się i rozdziela przepływające komórki. Poszczególne komórki wykazują zróżnicowaną autofluorescencję i rozproszenie światła. W zależności od stosowanych przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromami oraz typu analizy (mogą być wieloparametrowe) można badać zaburzenia ilościowe i jakościowe w subpopulacjach, obecność i gęstość pojedynczych epitopów na komórce, współzależności, monitorować leczenie a także przeprowadzać badania czynnościowe komórek układu odpornościowego (odpowiedź proliferacyjną pod wpływem mitogenów, stan aktywacji limfocytów poprzez określanie ekspresji antygenów charakterystycznych tylko dla pobudzonych komórek, np. receptora dla 11-2 (CD25), zdolność produkcji i uwalniania cytokin, cytotoksyczność T i NK, apoptozę, fagocytozę i wybuch tlenowy granulocytów). Badanie można przeprowadzić z krwi, szpiku, węzłów chłonnych, guzów nowotworowych, płynów ustrojowych itp. Cytometria najczęściej jest wykorzystywana do diagnostyki i monitorowania chorób limfoproliferacyjnych, a także w diagnostyce pierwotnych niedoborów immunologicznych, chorób autoimmunizacyjnych, chorych HIV(+), w transplantologii.

Koszty badania sąjednak bardzo wysokie, wymuszają jednakowe zasady pracy i standaryzację stosowanych metod celem ustalenia norm w zależności od wieku, płci.

4. Swoista odpowiedź immunologiczna - humoralna

Odpowiedź humoralna wiąże się z aktywacją i klonalną proliferacją limfocytów a następnie produkcją swoistych przeciwciał przez komórki plazmatyczne. W ocenie odpowiedzi humoralnej bada się więc poziom limfocytów B (na podstawie markerów powierzchniowych) i ich zdolność do proliferacji (pod wpływem mitogenów), stężenie immunoglobulin i ich podklas a także oznacza poziomy swoistych przeciwciał dla różnych antygenów. Do oceny poziomu immunoglobulin oraz poziomów swoistych przeciwciał wykorzystuje się różne odczyny serologiczne (przebiegające in vitro) oparte na reakcji antygen-przeciwciało.

Obserwacja efektów działania przeciwciał:

*precvpitacia pierścieniowa - wyłącznie jakościowy odczyn, na surowicę zawierającą przeciwciała nawarstwia się delikatnie antygen lub odwrotnie. W miejscu zetknięcia się i równowagi (strefa ekwiwalencji) powstaje pierścień precypitacyjny.

Studenci wykonują delikatnie precypitację pierścieniową, wykrywają w roztworze obecność np. toksyny jadu kiełbasianego

*odczvn lizy - wykorzystuje zdolność wiązania dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało i doprowadzenie do lizy (uszkodzenia) antygenu.

Studenci wykonują odczyn lityczny: do dwóch probówek dają: 2 krople 5% krwinek barana łub krwinek ludzkich, dodają 4 krople surowicy z przeciwciałami, (tworzy się aglutynacja), następnie dodają 6 kropli dopełniacza i inkubują w temp.ciala (ktoś trzyma w ręku). Liza występuje w układzie homologicznym. *odczvn wiązania dopełniacza (OWDV wykorzystuje się zdolność dopełniacza do lizy kompleksu: krwinka czerwona + swoiste przeciwciało. Odczyn jest dwustopniowy i zawiera układ testujący: surowica badana