3870137201

18 W BOCIAN. L KOZERSKJ

Z wykresu tego wynika, że w łańcuchu B znajduje się motyw a-helisy B8—B18 ponieważ inkrementy CSI mają ten sam znak dla wszystkich jednostek w tym zakresie i zmieniają znak (lub mają wartości bliskie 0) na końcach motywu strukturalnego (jednostki B7 i BI9). Natomiast w badanych insulinach przedstawionych na Rys. 12 w zakresie B24-B28 wartości inkrementów CSI są nieregularne i nie wykraczają poza zakres charakteiystyczny dla w'artości kłębka statystycznego co wskazuje na to, żc ta część łańcucha ma właśnie strukturę nieregularną. Badane insuliny nie mają więc elementu /2-kartki w tym zakresie i są insulinami monomcrycznymi. w odróżnieniu od insuliny przedstawionej na Rys. 12, która ma strukturę dimeru.

Ta prosta analiza wartości SHa umożliwia więc ocenę stanu agregacji białka w badanych warunkach w roztworze. Należ}'jednak zwrócić uwagę na fakt, żc analiza taka może nie być wystarczająca do ustalenia stanu agregacji w roztworze jeżeli np. cząsteczka monomeru jest w^f równowadze z dimerem a proces wymiany jest szybki w skali czasu NMR i obserwuje się uśrednione wartości przesunięć chemicznych.

W ostatniej dekadzie, wykorzystując szerokie zastosowanie cewek gradientowych w konstrukcji sond wysokiej rozdzielczości, rozwinięto metodę wyznaczania współczynników dyfuzji do badaniach oddziahwań międzycząstcczkowych. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania oddziaływań dużych cząsteczek biologicznych (DNA, RN A, białka, peptydy) z niskocząsteczkowymi ligandami organicznymi (patrz wyżej). Niemniej, może również być przydatna do rozróżnienia agregatów' insulinowych, np. dimeru i tetrameru [271.

Na Rys. 14, w projekcji na oś odciętych, przedstawione jest widmo insuliny ludzkiej w warunkach, w których równocześnie w roztworze występują dimer i tc-tramer w równowadze, w zakresie wolnej wymiany w skali czasu NMR. Ponieważ widmo wykonane jest w D,0, możliwe jest obserwowanie protonów C2-H histydyn B5 i B10 w zakresie 7,5 ppm. Ze względu na symetrię C„ w dimerze obserwujemy tylko 2 sygnały C2-H dla obu histydyn a 4 sygnały w liniowym tetramerze zawierającym płaszczyznę symetrii C_s. Przypisania sygnałów' obydwu agregatom dokonuje się na podstawie widma 2D DOSY [28,29] (ang. Diffiusion OrderedSpectroscopy), przedstawionym na Rys. 14, jako wyniku eksperymentu pomiaru współczynników dyfuzji widocznych na osi rzędnych dla poszczególnych sygnałów. Dimer i tetramer różnią się znacznie współczynnikami dyTuzji ze względu na różnicę parametrów hy drodynamicznych jako pochodnej różnej średnicy białka globu-lamego dimeru i tetrameru. Należy zwrócić mvagę, żc prawidłowe wartości współczynników dyfuzji w tym eksperymencie można wyznaczyć jedynie dla sygnałów obydwu indywiduów chemicznych, które są dobrze wyodrębnione i nic pokrywają się z innymi sygnałami, w szczególności pochodzącymi od indywiduum o innym współczynniku dyfuzji. Pokrywanie się wzajemne takich sygnałów zaburza prawidłowe wartości współczynnika dyfuzji, jak to wyraźnie widać na Rys. 14.