3870137213

26 A EJCHART

WSTĘP

Większość ważnych biologicznie pierwiastków, węgiel, azot, wodór czy fosfor, posiada trwałe izotopy, których jądra obdarzone spinem charakteryzują się wąskimi sygnałami w widmach magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Oddziaływania międzyjądrowe, które są czule nawet na małe zmiany struktury' i konformacji cząsteczki, wpływają na położenia, kształty i intensywności sygnałów NMR 11, 2J. Dzięki temu spektroskopia NMR stwarza możliwości otrzymywania w roztworach struktur cząsteczek o dużej dokładności. Dynamicznie rozwijające się w ostatnich latach badania NMR białek z jednej strony stwarzają możliwości porównywania struktur białek otrzymanych w krysztale i roztworze, zaś z drugiej strony umożliwiają badania takich białek, które nic krystalizują.

Ogromny potencjał badawczy' spektroskopii NMR na razie nie znajduje odbicia w liczbie struktur dostępnych w bazach danych; mniej niż 14% struktur białek zdeponowanych w Protein Data Bank (http://wwwrscb.org/pdb) zostało wyznaczonych w oparciu o dane uzyskane przy pomocy NMR. Taki stan rzeczy został spowodowany przez szereg przyczyn i warto wymienić podstawowe powody, które hamowały dotychczas szerokie wykorzy stanie NMR w wyznaczaniu przestrzennych struktur białek f3J.

Niska czułość spektroskopii NMR Obecnie typowa ilość białka potrzebna do badań NMR wynosi około 0,5 /ćM czyli o kilka rzędów wielkości więcej niż ilość potrzebna do pomiarów optycznych czy w spektrometrii mas. Ponadto białko nic powinno podlegać agregacji przy stężeniach rzędu 1 mM/1.

Czasochłonność pomiarów NMR. Białko musi być stabilne w roztworze w temperaturze pokojowej co najmniej przez kilkanaście dni.

Sygnały w widmach białek poszczególnych izotopów są silnie ponakladane. Na przykład w białku składającym się z 200 reszt aminokwasowych należy oczekiwać około 1200 sygnałów izotopu 'H, 1000 sygnałów izotopu ^I3C i ponad 200 sygnałów izotopu ^I5N występujących w wąskich przedziałach częstości.

Bardzo silny sygnał rozpuszczalnika jakim jest woda utrudnia obserwację widm ^lH NMR, zwłaszcza ważnego diagnostycznie obszaru sygnałów H_a.

W dużych białkach sygnały ulegają poszerzeniu tracąc strukturę subtelną ze względu na wolniejszą reorientację dyfuzyjną.

Więzy strukturalne otrzymane z widm NMR są niejednoznaczne, co powoduje, że ich liczba musi być znacznie większa od liczby konformacyjnych stopni

swobody.

*

Obecnie większość ty ch niekorzystnych właściwości widm NMR została przezwyciężona dzięki ogromnemu postępowi jaki dokonał się w budowie spektrometrów, projektow aniu nowych technik pomiarowych, znakowaniu izotopowym oraz procedurach komputerowych służących do otrzymania więzów strukturalnych i wykorzystaniu ich w obliczeniach strukturalnych. Dlatego w ostatnich latach liczba deponowanych w PDB struktur białek otrzymanych w oparciu o dane NMR rośnie lawinowo.