3870137253

50 Z GDANIEC

WSTĘP

Biomolekulama spektroskopia NMR jest obecnie jedyną metodą eksperymentalną pozwalającą na ustalenie struktury przestrzennej makrocząsteczek w roztworze z rozdzielczością atomową. Ma to szczególnie duże znaczenie dla rozwiązywania realnych zagadnień biochemicznych np. prób powiązania struktury cząsteczek z ich funkcjąw komórce. Zaletą ustalania struktur DNA i RNA metodami NMR jest ponadto możliwość rejestrowania funkcjonalnie istotnych zmian konformacyjnych cząsteczki, opis ich dynamiki oraz analiza procesów wiązania ligandów.

Postęp w dziedzinie spektroskopii NMR kwasów nukleinowych, zarówno DNA i RNA, dokonał się nic tylko dzięki konstrukcji coraz to nowocześniejszych spektrometrów wyposażonych w potężne magnesy nadprzewodzące (21,14 T - 900 MHz dla ’H), ale także dzięki rozwojowi wielowymiarowych technik heteroj ądrowych. Nieustannie pojawiająsię coraz to nowe techniki pomagające pokonać niedoskonałości tych stosowanych dotychczas. Postęp w dziedzinie spektroskopii NMR kwasów nukleinowych był również możliwy dzięki opracowaniu metod enzymatycznej syntezy RNA i, dużo później, DNA [1-6J pozwalających na otrzymywanie cząsteczek całkowicie znakowanych izotopami ^I3C, ^I5N i ²H oraz postępowi w dziedzinie syntezy chemicznej sekwencyjnie specyficznego znakowania fragmentów RNA (7J. Struktury kwasów nukleinowych otrzymywane metodami NMR są z coraz większą precyzją i dokładnością i mogą konkurować z najnowszymi osiągnięciami metod krystalograficznych. Chociaż całkowita liczba struktur 3 D kwasów' nukleinowych otrzymanych na podstawie danych NMR i zdeponowanych w bazie PDB (—600) jest wciąż zdecydowanie mniejsza niż liczba zdeponowanych w niej białek (> 3200), to statystyki dotyczące ilości pojawiających się nowych struktur DNA i RNA wykazują stały wzrost (http ://www.rcsb .org/). Trudności w ustalaniu struktur kwasów nukleinowych metodami NMR, w stosunku do białek, wynikają między innymi zc znacznie większej degeneracji przesunięć chemicznych spow odowanej małą różnorodnością jednostek nuklcotydowych, w porównaniu z ilością reszt aminokwasowych występujących w białkach. Ilość atomów wodoru w DNA i RNA w stosunku do wszystkich atomów w cząsteczce jest również bardziej niekorzystna dla kwasów nukleinowych. Skutkuje to potencjalnie mniejszą ilością dostępnych więzów, a w konsekwencji mniejszą dokładnością otrzymanych struktur.

Ustalenie struktury przestrzennej biomolckul metodami spektroskopii NMR jest procesem złożonym składającym się z wielu etapów, z któiych najważniejsze to:

a)    przy gotowanie próbki,

b)    zebranie danych eksperymentalnych, procesowanie widm NMR,

c)    przypisanie jak największej liczby sy’gnalów' rezonansowych ‘H, ¹³C, ¹⁵N

i³¹P,

d)    otrzymanie danych strukturalnych w formie więzów odległościowych pro-ton-proton (wielkości NOE), więzów dla kątów torsyjnych (wartości stałych sprzężenia), więzów kierunkowych (RDC),

e)    wyznaczenie struktur przestrzennych zgodnych z danymi NMR.