3893820129

przy stałej wartości jednego z trzech parametrów: natężenia, napięcia lub mocy. Przy stałym natężeniu tempo migracji białek pozostaje stałe, zwiększa się jednak wraz z czasem ilość wydzielanego ciepła, co prowadzi do ogrzewania się żelu. Podczas elektroforezy przy stałym napięciu tempo migracji spada wraz z czasem prowadzenia rozdziału, aczkolwiek stałemu zmniejszaniu ulega również ilość wydzielanego ciepła, dzięki czemu ogrzewanie się żelu jest minimalne. Przy stałej mocy tempo migracji spada wraz z czasem prowadzenia rozdziału, zaś ilość wydzielanego ciepła pozostaje stała w czasie, co prowadzi do grzania się żelu, ale w mniejszym stopniu niż podczas elektroforezy przy stałym natężeniu. Spośród wymienionych powyżej trzech wariantów najpowszechniej stosuje się elektroforezę przy stałym natężeniu prądu z uwagi na krótszy czas trwania rozdziału. Wartość przyłożonego natężenia powinna być dostosowywana do grubości żelu. Standardowo zaleca się prowadzenie elektroforezy przy natężeniu 12-30mA na każdy żel o grubości Imm i szerokości 10 cm (żele takie stosowane są na ćwiczeniach). Wartość przyłożonego natężenia zależy także od naszych oczekiwań względem jakości i czasu rozdziału białek.

Elektroforeza w warunkach natywnych.

Natywna elektroforeza białek w żelach poliakrylamidowych (Native PAGE) odbywa się w warunkach niedenaturujących. Zarówno bufor do elektroforezy jak i bufor w którym jest rozpuszczone białko nie zawierają substancji denaturujących (np. SDS, mocznik, chlorowodorek guanidyny), za wyjątkiem śladowych ilości detergentów niejonowych, które mogą być niezbędne do lizy błon biologicznych w analizowanych materiale biologicznym (jadra komórkowe, mitochondria, plastydy). Elektroforeza w warunkach natywnych pozwala na analizę kompleksów białkowych, które w warunkach denaturujących uległyby rozpadowi. Tempo migracji białek zależy od licznych czynników, takich jak wielkość białka, jego struktura przestrzenna, sumaryczny ładunek elektryczny, obecność związanych kofaktorów czy obecność modyfikacji potranslacyjnych. Sprawia to, że przewidywanie tempa migracji oraz analiza obrazu po elektroforezie mogą być problematyczne. Elektroforezę natywną można przeprowadzać zarówno w układzie ciągłego jak i nieciągłego żelu. Obecnie stosowane są liczne techniki natywnej elektroforezy, z których dwie są najpowszechniej używane: Blue Native PAGE (BN-PAGE) i Clear Native PAGE (CN-PAGE).

BN-PAGE jest najstarszą techniką natywnej elektroforezy białek. Wykorzystuje ona barwnik Coomassie Blue jako substancję nadająca białkom wypadkowy ładunek ujemny oraz uwidaczniająca ich migrację w żelu. BN-PAGE jest powszechnie stosowany do analizy kompleksów białkowych

0    zachowanej aktywności enzymatycznej. Tempo migracji białek zależy głównie od ich masy

1    konformacji. Po rozdziale elektroforetycznym prążek zawierający badany kompleks może zostać wycięty i rozpuszczony w buforze zawierającym SDS, zaś białka uwolnione z kompleksu rozdzielone techniką SDS-PAGE. Procedura ta jest czasem nazywana Two Dimensional Blue Native SDS-PAGE. Wadą techniki BN-PAGE jest to, że Coomassie Blue może w niektórych przypadkach działać jako detergent i powodować dysocjację kompleksów białkowych oraz hamować aktywność enzymatyczną. Ponadto, Coomassie interferuje z niektórymi technikami detekcji białek bazującymi na chemiluminescencji i fluorescencji (np. podczas analizy Western-blot).

CN-PAGE nie wykorzystuje barwników do nadawania białkom ładunku elektrycznego. Efektem tego jest ograniczenie tej metody do rozdziału białek o pi poniżej pH buforu (na ogół będą to białka o pl<7). Tempo migracji białek silnie zależy od ich natywnego ładunku elektrycznego. Brak detergentów sprawia, że białka mają tendencję do tworzenia agregatów, co objawia się mniejszą zdolnością rozdzielczą tej metody. CN-PAGE, w odróżnieniu od BN-PAGE, w mniejszym stopniu powoduje zaburzenia w aktywności enzymatycznej analizowanych białek oraz nie interferuje z dalszymi procedurami bazującymi na chemiluminescencji i fluorescencji. Istnieją modyfikacje tej metody, w której do stosowanych buforów dodaje się niewielkie ilości łagodnych detergentów niejonowych, które zapobiegają agregacji białek. W innym wariancie do buforów dodaje się niewielkie ilości detergentów anionowych, takich jak deoksycholan sodu, co również zapobiega agregacji, a także nadaje białkom ładunek ujemny i pozwala na analizę białek o pl>7.

SDS-PAGE

Najpowszechniej stosowaną techniką elektroforetycznego rozdziału białek w żelach poliakrylamidowych jest elektroforeza w obecności SDS (tzw. SDS-PAGE). SDS jest silnym detergentem anionowym, który niszczy struktury białkowe wyższego rzędu, denaturując białka