5192605685

U5] BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO — UGAND 47

ności równania 17. Ogromną wadą opisanej metodyki jest mikrohetero-genność rozmieszczenia ligandu, która zapewne wpływa na wyznaczane

parametry K i K, chociaż nie opublikowano dotąd prac ujmujących ilościowo tej efekt (111).

Oba powyższe ograniczenia można usunąć, przeprowadzając bezpośrednio syntezę żeli poliakryloamidowych zawierających kowalencyjnie związany ligand. Tego typu żele sporządzano przez dodanie glukozydów allilowych do zwykłej mieszaniny polimeryzacyjnej (133, 134). Sposoby takie nie były jednak jeszcze stosowane w ilościowych badaniach oddziaływań białko-ligand.

Dokładność wyznaczenia wartości K ściśle zależy od prawidłowego przyjęcia stężenia unieruchomionego ligandu (równanie 17). W wielu przypadkach jednak nie wszystkie reszty unieruchomionego ligandu są

dostępne dla białka, wskutek czego efektywne [L] jest niższe niż wyznaczone z całkowitej zawartości ligandu w żelu.

Dalszymi wadami metody ilościowej elektroforezy powinowactwa są: niemożność wyznaczenia stałych K dla naładowanych ligandów oraz ograniczenie do białek monowalencyjnych. Do tej pory omawianą metodą zbadano tylko jeden układ bardziej złożony — dimeryczną fosforylazę glikogenu (135). Opublikowane ostatnio teoretyczne rozważania (136), nie testowane jednak do tej pory eksperymentalnie, sugerują, że wartość K można oznaczyć również dla białek poliwalencyjnych (n > 1).

W tych przypadkach zamiast K otrzymuje się K/n. Być może w tym duchu należałoby interpretować pewne wątpliwości, które budzi praca nad oddziaływaniem albuminy surowicy z żelem zawierającym węglowodorowe podstawniki (137).

Wszystkie te ograniczenia tracą jednak na znaczeniu w konfrontacji z ogromnymi zaletami tej metody (111). Jest ona szybka, łatwa do zastosowania i zużywa minimalne ilości białka. Pozwala ilościowo charakteryzować wyjątkowo słabe oddziaływania (stałe rzędu 10—1 M^-1). Parametry wiązania można wyznaczyć jednocześnie dla kilku form białka, np. izoenzymów. W ogóle próbka białka nie musi być oczyszczona! Ponadto metoda jest praktycznie jedyną, która pozwala wykrywać i ilościowo charakteryzować heterogenność białek pod względem powinowactwa do unieruchomionych ligandów (112, 124, 125, 138—140). Chromatografia powinowactwa jest na ogół mało przydatna do tego celu, gdyż charakteryzuje się stosunkowo niską rozdzielczością (111).

Zaakceptowano do druku 27.07.1982

PIŚMIENNICTWO

1. Deranleau D. A., (1969), J. Am. Chem. Soc., 91, 4044—4049.

2. Thakur A. K., Jaffe M. L., Rod bard D., (1980), Anal. Biochem., 107, 279—295.