5192605673

BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO ■— UGAND 43

Tak czy inaczej, jeżeli ilość miejsc wiążących w rozpuszczalnym białku (n) nie jest z góry znana, nie można jej wyznaczyć przy zastosowaniu ilościowej chromatografii powinowactwa, przynajmniej w chwili obecnej. Natomiast nie przedstawia trudności wyznaczenie izotermy wiązania ligandów przez unieruchomione białka, co zaprezentowano na przykładzie oddziaływania pewnych leków z unieruchomioną albuminą surowicy (88). Wyznaczając objętości wymywania ligandów (V_L) z kolumny z unieruchomionym białkiem techniką analizy czołowej oraz posługując się równaniem 11:

v_L —v° = v_ż[B] — r    (równanie 11)

w którym V_ż oznacza objętość fazy żelowej, otrzymano krzywoliniowy wykres Scatcharda, interpretowany za pomocą modelu dwóch klas miejsc wiążących.

V. Klasyczne metody elektroforetyczne

Techniki elektroforetyczne pozwalają na mierzenie ruchliwości elektro-foretycznej białek — wielkości, która ulega znacznym zmianom wskutek oddziaływania białkowych makrojonów z innymi jonowymi substancjami. Z tego typu oddziaływaniami związany jest jednak szereg teoretycznych i praktycznych problemów, nie spotykanych w przypadku obojętnych ligandów. Zagadnienia te omówione są w cytowanych już pracach (3, 4). Oddziaływania elektrostatyczne sprawiają, że miejsca wiążące jony nie są niezależne. Uwzględnienie tego efektu prowadzi do wyrażenia na stałą mikroskopową:

k, = (k₀)i e-^2wZ“^Zl-    (równanie 12)

gdzie: Z_B — oznacza ładunek białka, Z_L — ładunek ligandu, a w jest pewną stalą, zależną m.in. od promienia makrojonu i ligandu. Równanie 3 przybiera wtedy złożoną postać:

n, (kp)i [L] ę~^2wZB^zt-1 +(k₀), [L] e-^2wZbZl

Jeżeli niewielka ilość jonów wiąże się z białkiem o małym ładunku netto, wtedy człon wykładniczy w równaniu 12 jest zanied by walny, co oznacza, że elektrostatyczne oddziaływania między miejscami wiążącymi można zignorować.

W przypadku, gdy ligandem jest jon metalu, badaną równowagę należy najczęściej rozpatrywać jako współzawodnictwo ligandu z jonami wodorowymi o te same miejsca wiążące.