5192605652

[5] BADANIE ODDZIAŁYWANIA BIAŁKO — LIGAND 37

ale również zniekształcenia wykresu Scatcharda, co prowadzić może do przyjęcia fałszywego modelu badanej równowagi (29).

Częściowa dysocjacja kompleksu ligand-białko może występować wskutek kompetycyjnego wiązania ligandu przez żel, zachodzącego w trakcie chromatografii,. Adsorpcję na żelach Sephadex obserwowano w przypadku wielu ligandów, m.in. sterydów i licznych barwników. Zaproponowano metody uwzględniania tego zjawiska w obliczeniach prawidłowych wartości funkcji r (27, 30). Mieszaninę inkubacyjną odpowiadającą pojedynczemu punktowi na izotermie wiązania dzieli się na kilka porcji, które poddaje się sączeniu molekularnemu na kolumnach zawierających różne ilości żelu (27). Wyznaczone wartości r są tym mniejsze im wyższa jest zawartość żelu w kolumnie. Z ekstrapolacji do zerowej zawartości żelu otrzymuje się poprawioną wartość r, używaną do konstrukcji wykresu Scatcharda. Opisana procedura ekstrapolacyjna pozwala również na uwzględnienie stosunkowo rzadkiego zjawiska adsorpcji białek na żelach chromatograficznych. Stwierdzono np. że albumina surowicy wiąże się z żelem Sephacryl (31).

Opisana w tym rozdziale prosta metoda chromatograficznego wyznaczania parametrów wiązania wymaga odpowiedniego doboru żelu, tak aby następowało dokładne oddzielenie ligandu związanego od ligandu wolnego. Przedstawiono teoretyczną analizę wpływu niepełnych rozdziałów na kształt i parametry wykresu Scatcharda (32). W badaniach oddziaływania białek z drobnocząsteczkowymi ligandami czynnik ten nie odgrywa jednak poważniejszej roli.

III-2. Metody równowagowe

Teoretycznie poprawniejsze metody muszą uwzględniać fakt, że w trakcie chromatografii mieszaniny białka i ligandu równowadze tworzenia kompleksu towarzyszy równowaga podziału wszystkich składników pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną. Jest to szczególnie ważne wtedy, gdy asocjacja lub dysocjacja kompleksu przebiega z szybkością porównywalną lub wyższą niż prędkość, z jaką prowadzi się rozdział chromatograficzny (33).

Najstarsza z tych metod opisana została przez Hummela i Dry-era (34). Na kolumnę z żelem, zrównoważoną i przemywany buforem zawierającym ligand w określonym stężeniu, nakłada się próbkę białka rozpuszczoną w tym samym roztworze. W trakcie strefowej chromatografii białko ulega nasyceniu ligandem do takiego stopnia r, jaki odpowiada użytemu stężeniu ligandu [L], Profil elucji (ryc. 1 B) charakteryzuje się linią podstawową, określającą równowagowe stężenie ligandu [L], dodatnim szczytem zawartości ligandu pokrywającym się ze szczytem białkowym, oraz ujemnym pasmem o objętości wypływu takiej, jak dla