Organizmy transgeniczne
MANIPULACJE
MATERIAA
EM
GENETYCZNYM ZARODKA
" zwierzęta transgeniczne (dodany gen);
" zwierzęta z usuniętym genem ( knock-out ;
wykorzystanie rekombinacji homologicznej);
" zwierzęta z genem usuwanym w określonym
narządzie, na określonym etapie rozwoju
(wykorzystanie rekombinacji homologicznej i tzw.
 site-specific ).
ORGANIZMY
TRANSGENICZNE
" organizmy niosÄ…ce eksperymentalnie
wprowadzony gen lub geny, które mogą
być przekazywane następnym
pokoleniom;
" wprowadzony gen określa się mianem
TRANSGENU
STRUKTURA TRANSGENU
0,2  2,0 kb 0,5  5,0 kb 0,2  0,3 kb
0,2  2,0 kb 0,5  5,0 kb 0,2  0,3 kb
promotor sekwencja kodująca sygnał
" dobrze scharakteryzowany, białko poliadenylacji
tkankowo-swoisty - dla " skonstruowana z DNA
uzyskania ekspresji transgenu genomowego lub z cDNA
w wybranym narzÄ…dzie badanego genu
" uniwersalny - dla uzyskania " białko reporterowe
ekspresji we wszystkich (wskaz
nikowe: CAT, GFP
tkankach luc, LacZ)
insulator insulator
SZTUCZNE
CHROMOSOMY
" mieszczą geny o wielkości od 2 kb do 1 Mb.
" BAC  bakteryjne:  bacterial artificial
chromosome ;
" YAC  drożdży:  yeast artificial chromosome ;
" PAC   P1 artificial chromosome .
9000
8000
WPA
YW
WPA
YW 7000
MIEJSCA
MIEJSCA
6000
INTEGRACJI
INTEGRACJI
5000
TRANSGENU
TRANSGENU
4000
NA JEGO
NA JEGO
3000
EKSPRESJ

EKSPRESJ

2000
1000
0
pHST "B pHST pHST "HSE
-CAT -CAT -CAT
INSULATORY
INSULATORY
" Sekwencje DNA stanowiÄ…ce barierÄ™
chroniącą gen przed wpływem otaczającej
chromatyny.
" Insulator z koÅ„ca 5 kurzej ²-globiny
stanowi granicę między chromatyną
 otwartÄ… i  skondensowanÄ… .
" Insulatory pomagają zachować niezależne
funkcjonowanie genów znajdujących się w
otoczeniu sekwencji regulatorowych, które
powinny być ignorowane.
OTRZYMYWANIE ZWIERZ
T
MODYFIKOWANYCH
GENETYCZNIE CELE:
" badanie mechanizmów regulacji ekspresji genów
(sekwencji promotora/enhancera genu);
" badanie roli białek w rozwoju ssaków, normalnej
fizjologii i chorobach;
" badanie lokalizacji białek (białka fuzyjne);
" konstruowanie modelów chorób;
" produkcja specyficznych białek w celach
farmaceutycznych;
" do przeszczepów narządów;
" zwiększanie odporności zwierząt;
" intensyfikacja produkcji zwierzęcej.
OTRZYMYWANIE MYSZY
TRANSGENICZNYCH
METODY:
" mikroiniekcja DNA bezpośrednio do przedjądrza
zapłodnionego oocytu;
" infekcja retrowirusowa embrionów
przedimplantacyjnych (do stadium blastocysty);
" wprowadzenie DNA do totipotencjalnych komórek
pierwotnej linii zarodkowej i ich iniekcja do jamy
blastocysty;
" klonowanie z wykorzystaniem modyfikowanych
genetycznie fibroblastów płodowych;
" za pomocą wektorów lentiwirusowych otrzymanych
na bazie HIV.
PIERWSZE MYSZY
TRANSGENICZNE
" wirus SV40 wprowadzony do jamy blastocysty (Jaenisch i
Mintz, 1974) - pozostał jako episom w tkankach
somatycznych;
" retrowirus M-MuLV wprowadzony do embrionów (Jaenisch,
1976) - pierwszy szczep myszy transgenicznych;
" gen interferonu ludzkiego sklonowany w pBR322 (Gordon i
Ruddle, 1980) - wprowadzenie terminu zwierzÄ…t
transgenicznych i transgenu;
" gen hormonu wzrostu szczura pod kontrolÄ… promotora genu
metalotioneiny myszy (Palmiter, 1982) - mikroiniekcja DNA
w formie liniowej;
" transgeny dostarczone przez lentiwirusy: 2002.
3. Mikroiniekcja DNA do
przedjÄ…drza
x
jednokomórkowych embrionów
1. Krzyżowanie samic po stymulacji
hormonalnej z samcami tego samego
szczepu
2. Pobranie jajowodów do medium i
wypreparowanie embrionów
4. Operacja wprowadzenia jedno-
lub dwukomórkowych embrionów
do bańki jajowodu matek
zastępczych
5. Narodziny młodych
po 19-tu dniach
(obecność transgenu
sprawdzana metodÄ…
PCR)
OTRZYMYWANIE MYSZY TRANSGENICZNYCH
OTRZYMYWANIE MYSZY TRANSGENICZNYCH
ZAPA
ODNIENIE
" hydratacja i despiralizacja
chromatyny plemnika -
przedjądrze męskie;
" równoczesne formowanie
przedjądrza żeńskiego;
rozwój zarodka w jajowodzie do stadium blastocysty;
rozwój zarodka w jajowodzie do stadium blastocysty;
hodowla embrionów in vitro - tylko do stadium
hodowla embrionów in vitro - tylko do stadium
blastocysty;
blastocysty;
zjawisko bloku w stadium dwukomórkowym.
zjawisko bloku w stadium dwukomórkowym.
Operacja wprowadzenia
embrionów do bańki
jajowodu matek
zastępczych
" wybór odpowiednich
samic na matki zastępcze:
szczep (kolor futra), wiek;
" sterylizacja samców
poprzez przerwanie
ciągłości nasieniowodów
(wazektomia);
" operacja na samicach
będących w ciąży
urojonej.
STRUKTURA TRANSGENU
promotor sekwencja kodująca sygnał
" dobrze scharakteryzowany, białko poliadenylacji
tkankowo-swoisty - dla " skonstruowana z DNA
uzyskania ekspresji transgenu genomowego lub z cDNA
w wybranym narzÄ…dzie badanego genu
" uniwersalny - dla uzyskania " białko reporterowe
ekspresji we wszystkich (wskaz
nikowe: CAT, GFP
tkankach luc, LacZ)
insulator insulator
INSULATORY - sekwencje DNA chroniÄ…ce transgen
przed wpływem otaczającej chromatyny
GENY REPORTEROWE
" wykorzystywane do identyfikacji elementów
regulatorowych promotora, do znakowania
komórek w eksperymentach transplantacyjnych,
itp;
" ich produkt jest Å‚atwy do wykrycia, nietoksyczny i
normalnie nie występuje w komórkach i tkankach
badanego organizmu;
" zwykle pochodzenia prokariotycznego;
" produkt wykrywany w homogenatach z całych
narządów lub in situ na poziomie pojedynczej
komórki.
GEN
ACETYLOTRANSFERAZY
CHLORAMFENIKOLU: CAT
" gen bakteryjny kodujÄ…cy enzym
warunkujący odporność na
chloramfenikol;
" nie znajdowany u wyższych
Eukariota;
" możliwość ilościowego oznaczania
produktu w ekstraktach z narządów.
ANALIZA AKTYWNOÅšCI BIAA
KA
REPORTEROWEGO CAT
acetylowany
14
C-chloram-
fenikol
14
C-chloram-
fenikol
GEN ²-GALAKTOZYDAZY:
lacZ
" gen bakteryjny;
" ekspresja wykrywana w formie
niebieskiego precypitatu na poziomie
pojedynczej komórki lub
kolorymetrycznie w lizatach z całych
narządów.
DETEKCJA ²-
GALAKTOZYDAZY
GEN GFP -  GREEN
FLUORESCENT PROTEIN
" gen pochodzÄ…cy z meduzy;
" EGFP  wzmocniona fluorescencja; kodony
dostosowane do aparatu translacyjnego
wyższych Eukariota;
" białko po wzbudzeniu emituje zielone światło;
" może być wykorzystane do obserwacji
procesów zachodzących w żywych,
rozwijajÄ…cych siÄ™ organizmach;
" widoczne również w materiale utrwalonym;
" detekcja na poziomie pojedynczej komórki.
WYKORZYSTANIE GENU
REPORTEROWEGO GFP
BADANIE
BADANIE
LOKALIZACJI
LOKALIZACJI
BIAA
EK
BIAA
EK
Białko fuzyjne
Białko fuzyjne
z EGFP
z EGFP
BADANIE FUNKCJI BIAA
EK
BADANIE FUNKCJI BIAA
EK
Badanie wpływu
Badanie wpływu
czynnika
czynnika
transkrypcji
transkrypcji
HSF1
HSF1
na proces
na proces
spermatogenezy
spermatogenezy
Transgen wprowadzony metodÄ…
Transgen wprowadzony metodÄ…
mikroiniekcji integruje z genomem w
mikroiniekcji integruje z genomem w
przypadkowym, niemożliwym do
przypadkowym, niemożliwym do
przewidzenia miejscu.
przewidzenia miejscu.
Wykorzystanie rekombinacji
Wykorzystanie rekombinacji
homologicznej umożliwia wprowadzenie
homologicznej umożliwia wprowadzenie
zmian do genomu w dokładnie
zmian do genomu w dokładnie
określonym miejscu.
określonym miejscu.