Cytogenetyczne i bakteryjne testy monitorowania
skutków zanieczyszczeń środowiska.
1. Test Amesa: wykorzystuje się do niego szczepy Salmonella
typhimurium pozbawione zdolności syntezy histydyny (his-). Wysiewa
się je na pożywkę zawierającą bardzo małe ilości histydyny oraz badaną
substancję wraz z frakcją S9 (ekstrakt z wątroby szczura, mający na
celu aktywację metaboliczną substancji). Bakterie rosną i namnażają
się, dopóki pożywka zawiera histydynę. Po jej zużyciu na pożywce
zostają jedynie te kolonie, w których nastąpiła mutacja, przywracająca
zdolność syntezy aminokwasu(rewersja). Po 72godzinach od
rozpoczęcia testu zlicza się kolonie rewertantów, porównując liczbę
rewertantów w próbie kontrolnej. Jeśli wynik znacznie przewyższa
wyniki z kontroli (minimum dwu-, trzykrotnie), to substancję uznaje
się za mutagen bezpośredni. Jest to test wysoce skuteczny w
wykrywaniu substancji rakotwórczych oraz testowania związków,
mających być użytymi jako leki.
2. Test strukturalnych aberracji chromosomowych: w teście tym
wykorzystuje się właściwości klastogenne (zdolność do łamania
chromosomów) badanych mutagenów fizycznych i chemicznych.
Uszkodzenia chromosomów można obserwować w stadium metafazy.
Test można przeprowadzać In vitro lub In vivo. W warunkach In vitro
materiałem mogą być limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty,
trofoblasty lub komórki płynu owodniowego. Do przeprowadzeniu
testu na limfocytach pobiera się krew żylną i zakłada hodowle
komórkowe. Limfocyty dodaje się do odpowiedniego medium
hodowlanego zawierającego badaną substancję w co najmniej trzech
stężeniach niższych od cytotoksycznego. Jeżeli komórki nie mają
możliwości aktywacji metabolicznej związku dodaje się frakcji S9. po
stymulacji limfocytów do podziału hodowlę utrzymuje się w 37 oC
przez 48 godzin. Na ostatnie 2 godziny podaje się inhibitor wrzeciona
podziałowego (kolchicyna). Następnym etapem jest przeprowadzenie
szoku hipotonicznego w 0.075 m KCl i utrwalanie komórek w
mieszaninie metanolu i kwasu octowego lodowego. Z uzyskanej
zawiesiny sporządza się preparaty mikroskopowe, które barwi się
metodą Giemzy i poddaje analizie. Do każdej dawki bada się co
najmniej 100 metafaz, zapisują liczbę chromosomów i rodzaj
występujących aberracji. W warunkach In vivo tes przeprowadza się na
dojrzałych płciowo myszach. Podaje się dożołądkowo lub
dootrzewnowo badaną substancję w kilku dawkach z zakresu 20-60
DL50. grupa kontrolna otrzymuje rozpuszczalnik danej substancji.
Związek podaje się na 30, 18 lub 72 godziny. Na 2-3 godziny przed
zakończeniem myszy uśmierca się, z kości udowej wypreparowuje się
szpik, który poddaje się zabiegom analogicznym do próbek In vitro.
Uzyskany materiał nanosi się na szkiełka i barwi metodą Giemsy.
Ocena polega na analizie mikroskopowej dokonywanej przez dwie
niezależne od siebie osoby. Za kryterium mutagenności środka uznaje
się znaczący procent aberracji w próbie badawczej w porównaniu z
kontrolną.
3. Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE): znalazł zastosowanie
w ocenie In vitro oraz In vivo. Podstawą badania jest
semikonserwatywna replikacja DNA. Jeśli do środowiska doda się
analog tyminy, 5-bromodeoksyurydynę (BrdU) to następuje jej
wbudowanie w miejsce tyminy. Prowadzi to do różnego wybarwienia
chromatyd po dwóch cyklach komórkowych. Chromatydy zawierające
BrdU barwią się słabiej niż normalne. W wybarwionych w ten sposób
chromosomach obserwujemy przemieszczenia się odcinków
homologicznych między chromosomami, reprezentowanych przez
różnie zabarwione odcinki jednej chromatydy, co określa się nazwą
wymiana chromatyd siostrzanych. Test wykonywać można na różnych
rodzajach komórek. Celem określenia własciowości genotoksycznych
związku wykonuje się test In vitro na limfocytach krwi obwodowej i In
vivo na myszach. Analiza polega na liczeniu punktów pęknięć i
przemieszczeń fragmentów chromatyd siostrzanych. Wyniki zestawia
się w tabelach. Badany związek który powoduje istotny wzrost
częstości SCE uznaje się za genotoksyczny.
4. test mikrojądrowy: jest jedną ze standardowych metod wykrywania
narażenia na czynniki mutagenne. Z jego pomocą wykrywa się skutki
działania czynników chemicznych i fizycznych, powodujących
złamania chromosomów oraz uszkodzenia wrzeciona podziałowego.
Na skutek zaburzeń wrzeciona chromosomy nie przesuwają się do
biegunów komórki, lecz zostają w cytoplazmie tworząc mikrojądra,
które powstawać mogą także z odłamanych fragmentów
chromosomów lub chromatyd nie posiadających centromerów.
Mikrojądra obserwuje się w komórkach interfazowych. Test wykrywa
działanie mutagenów bezpośrednich i wymagających systemu
aktywacyjnego (frakcja S9). Można go przeprowadzać In vitro i in vivo.
In vivo najczęściej wykorzystuje się erytrocyty polichromatyczne
szpiku kostnego lub śledziony dojrzałych myszy. Badaną substancję
podaje się w trzech dawkach dootrzewnowo lub dożołądkowo. Po
określonym czasie wykonuje się rozmazy komórkowe, które poddaje
się barwieniu metodą Giemsy i analizie mikroskopowej. Ocena
preparatu polega na określeniu:
" liczby erytrocytów polichromatycznych z mikrojądrami na 1000
badanych.
" Liczby erytrocytów polichromatycznych na 200
normochromatycznych.
Otrzymane wyniki poddaje się analizie statystycznej. Jeśli substancja
wywołuje statystycznie powtarzalny znamienny wzrost częstości
występowania erytrocytów polichromatycznych z mikrojądrami,
zostaje uznana za genotoksyczną. W warunkach In vitro test wykonuje
się na limfocytach krwi obwodowej. Do hodowli dodaje się
cytocholazynę B, która zatrzymuje cytokinez, nie zakłócając podziału
jądra. W efekcie otrzymuje się komórki dwujądrzaste, a także
wielojądrzaste. Analiza preparatu polega na ocenie 500-1000 komórek
dwujądrzastych z dobrze widoczną błoną komórkową i zachowaną
cytoplazmą pod kątem występowania mikrojąder, barwiących się jak
normalne jądro. Jeżeli substancja powoduje znaczny wzrost ich
występowania zostaje uznana za genotoksyczną.