6404670983

7/(II)/2012

BioLetyn

Str. 5

r

Ścieżki wiedzy

Zobaczyć niewidoczne, czyli o metodzie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Bakterie są mikroorganizmami bardzo chętnie wykorzystywanymi przez człowieka w wielu procesach technologicznych jednak, jak to mikroorganizmy, są niewidoczne gołym okiem. Aby określić z którymi bakteriami mamy do czynienia możemy obserwować ich cechy morfologiczne pod mikroskopem lub wykonać testy biochemiczne, analizując powstałe produkty. Można też wykorzystać metody zaczerpnięte z genetyki i biologii molekularnej.

Genetyczne i molekularne metody analizy jakościowej mikroorganizmów należą do bardziej precyzyjnych i czułych od metod biochemicznych ze względu na analizę ich genotypu. Pozwala to jednoznacznie określić gatunek lub zawęzić możliwość do bardzo wąskiej grupy, co w przypadku analizy cech morfologicznych jest możliwe jedynie dla dobrze poznanych grup mikroorganizmów [1],

Jedną z takich metod jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH ang. fluorescent in situ hybridization). Metoda ta polega na przyłączaniu się wyznakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej do komplementarnej sekwencji markera molekularnego występującego w komórce bakteryjnej [2]. Rolę markera pełnią najczęściej sekwencje nukleotydowe rRNA ze względu na występowanie licznych kopii w każdej komórce (nawet do kilkunastu tysięcy) co zwiększa prawdopodobieństwo zajścia hybrydyzacji i wydajność procesu. Charakteryzują się także dużym konserwatyzmem, zarówno struktury, jak i funkcji. Najczęściej wykorzystuje się sondy ukierunkowane na 16S rRNA, rzadziej na 23S rRNA [3]. Zaletą tej

Jł

Hybfydyzacja

Rys.l Schemat etapów FISH wg [3].

metody jest możliwość dokonywania pomiarów bezpośrednio na próbce środowiskowej bez konieczności wcześniejszego izolowania materiału genetycznego, gdyż bakterie zostają unieruchomione na podłożu.

FISH składa się z kilku etapów: utrwalenia materiału biologicznego, dehydratacji próbki, hybrydyzacji, usunięcia niespecyficznie związanych sond i analizy z użyciem mikroskopu

I odpowiedniego oprogramowania (rys. 1) [4,7]

Na początku procedury analizowaną próbkę środowiskową należy odpowiednio przygotować, aby zapobiec lizie komórek w czasie hybrydyzacji oraz przechowywania samej próbki. W tym celu wykorzystuje się 4% paraformaldehyd (PFA) dla bakterii Gram-ujemnych lub etanolu dla bakterii Gram-dodatnich. Następnie próbkę utrwala się na szkiełku do hybrydyzacji i wykonuje dehydratację w rosnącym stężeniu etanolu. Etap ten powoduje przerwanie ciągłości błony cyto-plazmatycznej, a tym samym zwiększa jej przepuszczalność dla dodawanych sond. Do próbek dodaje się specjalnie przygotowane sondy oligonukleotydowe o sekwencji komplementarnej do rRNA bakterii jakich poszukujemy (tab.l). Aby miejsce przyłączania się było widoczne, sondy są znakowane poprzez dołączanie odpowiednich florochromów, które pod wpływem fali światła o odpowiedniej długości emitują falę

0    długości w zakresie światła widzialnego (tab. 2). Sondy do hybrydyzacji umieszcza się w buforze zawierającym w swoim skłaldzie formamid (FA), który wpływa na ilość powstających wiązań wodorowych i stabilizuje powstający kompleks sondy z rRNA. Stężenie FA jest różne w zależności od użytej sondy, jednak zazwyczaj nie większe niż 50%. W podwyższonej temperaturze dochodzi do denaturacji dwuniciowych fragmentów kwasów nukleinowych i sonda może zostać komplementarnie przyłączona, po czym próbki przenoszone są do buforu płuczącego aby wymyć te, które się nie związały [3,7], Ostatnim etapem jest obserwacja mikroskopowa w celu określenia obecności danych grup mikroorganizmów (rys. 2). Barwniki fluorescencyjne ulegają rozkładowi pod wpływem światła

1    wysokiej temperatury, dlatego szkiełka do obserwacji należy przechowywać w zamknięciu i niskiej temperaturze.

Tab.l Przykładowe sondy oligonukleotydowe, wg [3]

na (wykrycia nie-