8009766941

Część eksperymentalna

Materiały:

-    DNA faga X (stężenie 0,3 pg/pl)

-    enzymy restrykcyjne Hindlll (10 U/pl), Mphl 1031 (10 U/pl)

-    bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10 x stężony): 10 mM TrisCl (pH 8,5 w 37°C), 10 mM MgCl₂, 100 mM KC1, 0,lmg/ml BSA

-    bufor TBE (10 x stężony): IM Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA

-    bufor do nakładania na żel (6 x stężony): 15% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% xylene cyanol FF

-    bromek etydyny 10 mg/ml

-    ATPlOmM.

Wykonanie:

Mapę restrykcyjną faga X z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mphl 1031 oraz Hindlll prezentuje Ryc. 1.5. Kolejne etapy prowadzonego eksperymentu zostały przedstawione w formie schematu (Ryc. 1.6).

1. Nastawienie trawienia DNA faga X enzymem Hindlll

Wykonanie: zmieszać 12,5 pl mieszaniny H (zawiera bufor i enzym Hindlll) z 12,5 pl mieszaniny Al (zawiera DNA faga A). Inkubacja w temperaturze 37 °C, 10 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Hindlll):

-    2,5 pl buforu do trawienia

-    2,5 pl (0,9 pg) DNA faga

-    19,5 pl H₂0

-    0,5 pl enzymu restrykcyjnego Hindlll

2.    Nastawienie trawienia DNA faga X enzymem Mphl 1031

Wykonanie: zmieszać 5/// mieszaniny M (zawiera bufor i enzym Mphl 1031) z 5pl mieszaniny A2 (zawiera DNA faga A). Inkubacja w temperaturze 37 °C, 40 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Mphl 1031):

-    1 pl buforu do trawienia

-    0,5 pl (0,15 pg) DNA faga X

-    8,3 pl H₂0

-    0,2 pl enzymu restrykcyjnego Mphl 1031

3.    Inaktywacja termiczna enzymu restrykcyjnego Hindlll Inkubacja próbki w temperaturze 65°C, 20 min.

4.    Przygotowanie reakcji ligacji

-    pobrać 20 pl pociętego enzymem Hindlll DNA faga X (4/5 reakcji trawienia z pkt. 1)

-    dodać 5 pl mieszaniny ligacyjnej

Reakcję inkubować w temperaturze pokojowej 15 min.

Skład mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia - 0,5 pl, 10 mM ATP - 2 pl, H₂0 - 2,2 pl, ligaza- 0,3 pl.

11