8009766948

Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie y-fosforanu z ATP (Ryc. 4.3) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5’ OH jedno- lub dwu-niciowego DNA, RNA lub oligonukleotydów.

ATP

ADP

Ryc. 2.3 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate).

Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji podstawienia (ang. forward reactioń) i reakcji wymiany (ang. exchange reactioń) (Ryc. 2.4). W reakcji podstawienia y-fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5’ (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w takiej postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji wymiany, nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie y-fosforanu z ATP (np. [y-³²P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stężenie ATP powinno wynosić >lpM (reakcja podstawienia) lub >2pM (reakcja wymiany). Ponadto enzym posiada aktywność 3’ fosfatazy.

reakcja wymiany

reakcja podstawienia

5' HO-OH 3'

ATP ——|

ICHBłSJ

I-► ADP

5’ O-OH 3'

Ryc. 2.4 Aktywność enzymatyczna T4 PNK.

Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego też źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli z wklonowanym genem pseT bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym z podjednostek o masie 28,9 kDa każda.

T4 PNK jest głównie wykorzystywana do:

-    radioaktywnego znakowania na końcu 5’ kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia lub wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy żelowej; (iv) jako startery w reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych metodach wymagających terminalnie wyznakowanego DNA.

-    5-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją.

18