8009766949

Termostabilne polimerazy DNA przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA w kierunku 5’—>3’ (Ryc. 2.5). Proces ten polega na dodawaniu deoksyrybonukleotydów do końca 3’ nowosyntetyzowanej nici. Do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą 3-OH oraz jony Mg⁺. Maksymalną aktywność katalityczną enzymy te wykazują w temperaturze 75-80°C. W temp. 37°C osiągają jedynie około 10% aktywności maksymalnej.

termostabilna polimeraza DNA

5’ DNAoh-► 5’ DNA - (_pdN)_n + nPPj

Mg²⁺

dATP. dTTP. dGTP, dCTP

Ryc. 2.5 Reakcja katalizowana przez termostabilną polimerazę DNA.

Tabela 5. Właściwości wybranych termostabilnych polimeraz DNA* (wg Sambrook, J. i Russell, D.; 2001)._____

Enzym	Organizm	Optymalna temperatura (°Q	Aktywność cgzonuklcolityczna	Częstość błędów xl0‘^6	Stabilność	Inne uwagi
Taq	Thermus acjuaticus	75-80	5’—>3’	20 - 100	9 min w 97,5°C	produkt PCR posiada na końcu 3' dA** 94 kDa monomer
Pwo	Pyrococcus woesei	60-65	3’—*5’	3,2	> 120 min w 100°C
Pfu	Pyrococcus furiosus	72-78	3’—5'	1.6	240 min w 95°C	produkt PCR posiada tępe końce 90 kDa monomer

♦poszczególne wartości mogą odbiegać od podanych w tabeli i różnić się w zależności od producenta ♦♦polimeraza DNA Taq wykazuje aktywność transferazy nukleotydowej, ale nie ma aktywności proojreading (egzonukleolitycznej 3'->5’), co powoduje dodanie dodatkowej reszt/y adeninowych na końcu 3' produktu PCR

Dostępne są również mieszaniny kilku termostabilnych polimeraz DNA np. High Fidelity PCR Enzyme Mix czy Long PCR Enzyme Mix. Umożliwiają one amplifikację fragmentów DNA o wielkości: (i) do 47 kpz z wirusowym DNA jako matrycą lub (ii) do 21 kpz z genomowym DNA jako matrycą.

Zastosowanie termostabilnych polimeraz DNA:

-    ampliftkacja fragmentów DNA w reakcji PCR;

-    znakowanie DNA;

-    sekwencjonowanie DNA;

-    wbudowywanie zmodyfikowanych nukleotydów (np. nukleotydów znakowanych biotyną, digoksygeniną lub fluorescencyjnie);

-    mutageneza specyficzna wobec miejsca;

19