101943

•    Termostabilne polimeazy DNA, opt działania ok. 72stC. Pozyskiwane z termofilnych bakterii (ich geny zostały sklonowane)

•    Początkowo najbardziej popularna Taq poi i mera za z Thermus aquaticus, brak aktywności korektorskich, wprowadzała liczne błędy podczas syntezy nowej nici.

•    Najmniej błędów polimeraza Pfu z Pyrococcus fnriosus czy sekwenaza, wybór konkretnej podyktowany jest założonym celem

•    Czułość reakcji- zależy mi a od jakości preparatów DNA i często niższa od teoretycznej. Skutek obecności w tkankach naturalnych inhibitoró polimeraz

•    Ostateczne efekty- obraz uzyskany po rozdziale produktów reakcji w żelach agarozowych czy PAA. Najprostsza sytuacja to taka, w której produkty powinny być widoczne w postaci ostiych prążków o określonej wielkości, porównanej ze znanym markerem (i jednoczesny ich brak w tzw próbie kontrolnej). Najłatwiej ulegają amplifikacji krótkie odcinki DNA (zwykle 100-900pz). Możliwe powielanie fragmentów rzędu lOkpz (przy opt warunkach PCR- long PCR dla odcinków długości kilku tys pz.

Termocy klery:

•    Aparaty prceznaczone do prowadzenia reakcji amplifikacji- termocyklery. Podstawowy element- elektroniczny, sterowany programem blok grzejny. Program umożliwia wprowadzenie wszystkich parametró reakcji- liczba cykli, czas trwania poszczególnych etapów, temp każdego z nim

•    Systemy nowszej generacji wyposażone w oprogramowanie, które po wprowadzeniu do nich danych o sekwencjach starterowych automatycznie dobierają warunki reakcji

•    Relatywna prostowa, wysoka specyficzność i czułość metody uczyniła ją powszechnie stosowaną unie tylko w badaniach podstawowych, ale także w analizach podobieństw genetycznych, wykrywaniu i identyfikacji obecności transgenów czy czynników chorobotwórczych, w medycynie sądowej, diagnostyce molekularnej, przygotowaniu fragmentów DNA do sekwencjonowania

•    Technika, bazując na swoich podstawowych zasadach, doczekała się licznych modyfikacji, rozszerzają wachlarz ismiejących technik molekularnych

Postęp dzięki PCR- dziedziny:

•    Badania podstawowe (poznawcze)- mapowanie i sekwencjonowanie genomów (m,in HGP), taksonomia, antropologia

•    Biotechnologia- produkcja rekombinowanych białek (insulina, hormon wzrostu), wykorzystywane jako leki, rozwój technologii rekombinowanych szczepionek (przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby)

•    Badanie chorób dziedzicznych- wykrywanie mutacji genów przekazywanych dziedzicznie (hemofilia, mukowiscydoza), genotypowanie zgodności tkankowej między dawcą a biorcą

•    Badania nkologiczne- identyfikacja mutacji w genach raka

•    Medycyna sądowa- namnażanie sekwencji wykorzystywanych do identyfikacji osób na podstawie analizy próbek DNA

Analizy porównawcze, diagnostyka molekularna, identyfikacja wszystkich typów sekwencji w tym

elementów genomu organizmów modyfikowanych genetycznie (np. transgenów)

Modyfikacje PCR:

•    RT-PCR (reverse transcriptase PCR)- reakcja odwrotnej transkrypcji z następującą po niej reakcją PCR

•    PCR multipleks- jednoczesna amplifikacja kilku fragmentów DNA różniących się wielkością

•    RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA)- losowa amplifikacja polimorficznego DNA

•    PR1NS-PCR (primed in situ labelling)- znakowanie in situ