8009766955

Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia.

Przykład:

Smal    Cfr9I    Acc65I    KpnI

CCC^lGGG    C‘CCGGG    G'GTACC    GGTAC^lC

GGG,CCC    GGGCC_tC    CCATG_fG    C_tCATGG

Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1 pg w czasie 1 godziny i w temperaturze i warunkach właściwych dla danego enzymu.

REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Ryc. 1.3):

- tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;

5'-GG*CC-3'    ^    5'-GG-3'    5'-CC-3'

3'-CC_tGG-5'    *    3'-CC-5'    3'-GG-5'

- lepkie końce - 3' lub 5' - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 3).

Hindlll

A‘AGCTT

TTCGA.A

ł

5'-A-3'    5'-AGCTT-3'

3' -TTCGA-5'    3'-A-5'

Mphll03I

ATGCA' T T, ACGTA

ł

5'-ATGCA    T-3'

3'-T    ACGTA-5^f

Ryc. 1.3 Enzym restrykcyjny Hindlll generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5’ a enzym Mphl 1031 jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3’.

Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy klonowaniu:

-    warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych)

-    wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu polimerazy DNA

Sekwencja palindromiczna - sekwencja czytana w kierunku od 5’ do 3’ końca jest taka sama jak na nici komplementarnej.

5'- AAGCTT -3'

3'- TTCGAA -5'

Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego

1.    Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w różnych, często ekstremalnych, środowiskach. Stąd wynikają różne preferencje warunków reakcji związane np. z temperaturą inkubacji. Inne elementy, które różnią bufory wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji z danym enzymem to: siła jonowa (stężenie soli), główny kation (sód lub potas) i pH. Każdy enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg²⁺!

2.    Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które wspomagają działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do

6