7960662475

ZASTOSOWANIE METODY PCR DO RÓŻNICOWANIA DROŻDŻY PRZEMYSŁOWYCH 71

próżniowej z wirującym rotorem (Speedvac) firmy Savan i zawieszono w 50 pl wody. Przechowywano w temp -20°C.

Amplifikację DNA przeprowadzono stosując primer mikrosatelitamy (GTG)s [6]. Syntezę primera wykonała na zamówienie niemiecka firma ARK.

Profil termiczny - PCR program (GTG) 5:

40 cykli:

93°C - 20 sek. (denaturacja dwuniciowego DNA),

50°C -1 min (przyłączanie primera (GTG)s),

72°C - 20 sek (powielanie homologicznych fragmentów DNA),

72°C - 6 min (powielanie DNA),

4°C - zakończenie reakcji PCR (chłodzenie).

Reakcje PCR wykonano z udziałem termostabilnej Taq polimerazy PCR firmy Quiagen oraz przy użyciu termocyklera DNA Engine PTC - 200 Peltier Thermal Cyc-ler firmy MJ Research.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Produkty reakcji PCR oznaczono elektroforetycznie, stosując 0,8% żel agarozowy z bromkiem ety dyny oraz markerem masy (100 bp DNA Ladder firmy Promega) o wielkości fragmentów 1500, 1000,900,800,700,600, 500,400,300,200,100 bp.

Rozdział DNA na żelu agarozowym rejestrowano przy pomocy telewizyjnego zestawu do rejestracji obrazu firmy Sony.

Wyniki i dyskusja

Analizując rozdział fragmentów DNA szczepów Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086 i Saccharomyces diastaticus ATCC 13006 oraz ich mieszańców SI, S3, S4 S6, S8 (Rys. 1) stwierdzono, że jedynie dwa szczepy S2 i S3 mogły być uznane za fuzanty. Hybryd S2 zawierał dwa fragmenty DNA (ponad 1500 bp i 675 bp) stwierdzone również w szczepie rodzicielskim Saccharomyces diastaticus ATCC 13006 oraz dwa inne fragmenty (1300 bp i 600 bp) typowe dla drugiego rodzica Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086. W odróżnieniu od fuzanta S2 fuzant S3 zawierał tylko po jednym regionie typowym dla każdego szczepu rodzicielskiego (675 bp) odpowiadający Saccharomyces diastaticus 13006 i (1300 bp) typowy dla Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086. Ponadto w obu hybrydach stwierdzono obecność jednego fragmentu DNA o wielkości 400 bp występującego u obu szczepów rodzicielskich. Jednoznaczne stwierdzenie, od którego z rodziców pochodzi ten fragment, wymagałoby dalszych analiz. Pozostałe produkty fuzji szczepów Saccharomyces diastaticus 13006 i Schwanniomyces occidentalis ATCC 48086, posiadały fragmenty DNA identyczne z