8857685814

działanie inhibitorów fosfataz. Wyjątkiem są rośliny o chromosomach policentromerycznych, u których fosforylowane są histony H3 na całej długości chromosomów. W przypadku podziałów mejotycznych istnieją różnice pomiędzy pierwszym a drugim podziałem. Podczas pierwszego podziału mejotycznegofosfoiylowane są histony H3 na całym chromosomie, podczas gdy w trakcie drugiego podziału fosforylacja ograniczona jest, podobnie jak w mitozie, do obszarów perycentromerów. Podobny profil wykazuje również fosforylacja histonu H3 w serynie 28.

Tak szczegółowy obraz zmian modyfikacyjnych poznano przy użyciu przeciwciał specyficznych dla ufosforylowanych epitopów histonu H3.

Kultury zawiesinowe komórek roślinnych stanowią homogenną populację komórek, łatwo dostępnych dla podawanych z zewnątrz substancji i rosnących w określonych, sterylnych warunkach. Są zatem dobiym materiałem do badań ścieżek metabolitów wtórnych, indukcji enzymów, czy ekspresji genów. Stosunkowo łatwa jest także izolacja enzymów i innych białek z komórek hodowanych w zawiesinie. Brak lub niewielka zawartość chlorofilu i innych barwników ułatwia doświadczenia. Stosując różnego rodzaju inhibitory można synchronizować zawiesiny komórkowe, czyli doprowadzić do stanu, w którym wszystkie komórki w zawiesinie znajdują się na tym samym etapie cyklu komórkowego. Poprzez „głodzenie” komórek można zahamować podziały komórkowe i wprowadzić je w fazę G₀.

W trakcie ćwiczeń jako materiał badawczy posłuży linia komórkowa tytoniu TBY-2.

Linia komórkowa TBY-2 (Tobacco Bright-Yellow) została wyprowadzona z komórek mezofilu liści przez Nagatę i współpracowników na początku lat 90-tych. Komórki hodowane są w płynnej pożywce MS (Murashige i Skoog) wzbogaconej o 2,4-D i witaminę B5, w ciemności, w temperaturze ok. 25°C przy stałym wytrząsaniu (125 obrotów na minutę).

Celem ćwiczenia jest porównanie poziomu fosforylacji histonu H3 w komórkach dzielących się i komórkach zatrzymanych w fazie G_# cyklu komórkowego.

Przejście zawiesiny do G₀ uzyskuje się w przypadku komórekTBY-2 przez30-krotne obniżenie zawartości sacharozy w pożywce.

Przebieg doświadczeń:

Dzień 1. Izolacja białek z materiału roślinnego (ok. 3 h)

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek zależą od właściwości danego białka. Poniżej, podano procedurę izolacji histonów rdzeniowych. Należy jednak pamiętać, że obok histonów metodą tą ekstrahuje się również wiele innych białek. Materiały:

-    zamrożony materiał biologiczny (komórki hodowane w 0.1% i 3% sacharozie)

-    ciekły azot

-    lód

-    probówki wirówkowe na 30 ml lub falkony 50 ml

-    duża wirówka z chłodzeniem

-    kołyska laboratoryjna

-    moździerze i tłuczki

-    homogenizator IKA

-    miracloth lub gaza

-    suszarka (zimny strumień powietrza)

-    waga laboratoryjna Odczynniki:

-    bufor HI (Histone Isolation):

10 mM Tris-HCl pH 7.5 2 mM EDTA 0,25 M HC1

5 mM p-mercaptoethanol* ^

0,2 mM PMSF

(Phenylmethanesulfonyl fluoride)*

* dodać nie wcześniej niż 30 min. przed izolacją

-    100% TC A

-    5x SDS loading buffer (60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.025% Bromophenol Blue)

-    1MDTT

-    zimny aceton (-20°C)

W trakcie izolacji nie należy ogrzewać materiału, trzeba dbać o utrzymanie niskiej temperatury poprzez trzymanie próbek w lodzie lub pracę w chłodni. Wszelkie wirowania należy przeprowadzać w schłodzonej do 4°C wirówce.

Pierwszym etapem jest uszkodzenie komórek w celu uwolnienia białek. Następnie białka wytrącane są kwasem trój chlorooctowym (TC A). TCAjest usuwany poprzez płukanie acetonem.