Diagnostyka

laboratoryjna chorób

przewodu pokarmowego

cz.2

Zmiany aktywności enzymów w

wybranych schorzeniach wątroby

Żółtaczki

•Hiperbilirubinemia i żółtaczka mogą być

objawem chorób o różnej etiologii i samo stwierdzenie
hiperbilirubinemii

musi

być

rozpatrywane

w

kontekscie okoliczności jej wystepowania. Czasem dla
celów

dydaktycznych

dzieli

się

zółtaczki

na

przedwatrobowe,

wątrobowe

i

pozawątrobowe.

Podział ten nie jest ścisły ponieważ najczęściej
przyczyny żółtaczki są złożone i obejmują zarówno
mechanizmy poza wątrobą jak i w samej wątrobie.

Żółtaczki

*

A.

Żółtaczka hemolityczna

powstaje w

następstwie wzmożonej hemolizy erytrocytów co
prowadzi do uwolnienia dużych ilości bilirubiny.
Zmienia się równowaga pomiędzy wychwytem
bilirubiny i jej napływem drogą osocza. W
konsekwencji następuje wzrost stężenia bilirubiny
we krwi. Żółtaczki hemolityczne charakteryzują się
umiarkowanie zwiększonym stężeniem bilirubiny
wolnej we krwi i umiarkowanie zwiększonym
wydalaniem urobilinogenu z moczem przy znacznie
zwiększonym wydalaniu sterkobilinogenu z kałem.
Brak jest objawów uszkodzenia wątroby.

Żółtaczka noworodków

jest jednym z

przykładów żółtaczki hemolitycznej

Zaburzenia metabolizmu bilirubiny w

różnych rodzajach żółtaczek

Charakterystyka wirusów

hepatotropowych

Wstępne testy diagnostyczne w

wirusowych zapaleniach wątroby

IgM anty HAV

wykrywa ostre WZW

typu A

HBsAg

wykrywa ostre lub przewlekłe

WZW typu B

Anty-HCV

wykrywa ostre lub

przewlekłe WZW typu C

WZW A

HAV wywołujacy WZW A jest wirusem RNA należącym do

rodziny Picornaviridae, rodzaju enterowirusów.

Zakażenie szerzy się drogą pokarmową.

HAV wykazuje bezpośrednie działanie hepatotoksyczne,

jednakże nie można wykluczyć uszkodzenia wątroby przez

immunologiczną odpowiedź gospodarza.

Okres wylęgania wynosi 15-49 dni (średnio 28 dni)

MARKERY ZAKAŻENIA HAV

Antygen wirusowy HAAg wykrywalny w kale na kilkanaście dni przed
wystąpieniem
klinicznych objawów choroby, utrzymuje się przez kilka dni w okresie
rozwiniętych objawów klinicznych.

Przeciwciała anty-HAV

·

anty-HAV-IgM

pojawiają się 18-41 dni po zakażeniu i

utrzymują się zwykle 2-3 miesięcy.

Są dowodem ostrej fazy zakażenia i świadczą o

zakaźności chorego.

· anty-HAV-IgG

Najwyższe miana stwierdza się w okresie

rekonwalescencji.

Utrzymują się latami, często przez całe życie. Są

dowodem odporności na

zakażenie HAV.

WZW B

Czynnikiem etiologicznym WZW typu B jest kompletny wirus, zwany
cząstką Dane‘a (

rdzeń DNA, polimeraza pDNA, białka nukleokapsydu

c, s, e

)

Zakażenie drogą parenteralną.

Okres wylegania wynosi 28-160 dni.

 u 90 % pacjentów dorosłych rozwija się ostre zapalenie wątroby
kończące się pełnym
wyzdrowieniem.

u 10 % pacjentów dorosłych zakażenie z fazy ostrej przechodzi w
przewlekłą

Klinicznie przewlekłe zapalenie wątroby będące konsekwencją
niewyeliminowania wirusa
po fazie ostrej podejrzewa się gdy po upływie 6 miesięcy brak
normalizacji klinicznej i biochemicznej oraz utrzymują się znaczniki
HBV w surowicy.

W zapaleniu przewlekłym wyróżniamy:

fazę replikacji

pacjent zakaźny

wykrywalne markery replikacji DNA-HBV* oraz pDNA-HBV*

HBsAg(

+) HBeAg(+) anty-HBc(+)

Okrse serokonwersji zanik HBeAg i pojawienie się anty-Hbe,
replikacja nadal obecna* u 50% chorych

fazę integracji

pacjent niezakaźny

nie wykrywa się DNA-HBV oraz pDNA-HBV

HBsAg(+), anty HBe(+), anty

HBc(+)

MARKERY ZAKAŻENIA HBV

·

HBsAg

Pojawia się na 2-4 tyg przed wzrostem aktywności

transaminaz. Jeżeli dochodzi do całkowitej eliminacji wirusa z ustroju
HBsAg zanika 1-6 tyg (może przetrwać do 20 tygodni).
·

HBeAg

Pojawia się w surowicy kilka dni po HBsAg, utrzymuje się

przez 3-9 tygodni. Przetrwanie dłużej niż 10 tyg rokuje przejście
zakażenia ostrego w przewlekłe. HBeAg jest markerem zakaźności osób
zarażonych HBV. Jego obecność jest skorelowana z wystepowaniem
licznych cząstek Dane'a w surowicy, HBV-DNA, polimerazy DNA i HBcAg
w hepatocytach. Jest markerem replakcji HBV.

·

Anty-HBc IgM

Pojawiają sie w surowicy 3-5 tyg po antygenemii HBs, a

więc na krótko przed objawami klinicznymi lub równolegle z nimi.
Wysokie miana utrzymują się przez cały okres antygenemii HBs i są
wykrywalne także gdy HBsAg zanika, a anty-HBs jeszcze się nie pojawiły.
Anty-HBc IgM zanikają w okresie 3-24 miesięcy. Są najpewniejszym
dowodem trwającego zakażenia HBV. Ich niskie miana zmogą przetrwać
gdy rozwija się zapalenie przewlekłe.
·

Anty-HBc IgG

Pojawiaja się kilka tyg po Anty HBc IgM i utrzymują

latami jako dowód przebytego zakażenia HBV.
·

Anty-HBe

Pojawiaja się kilka-kilkunastu dni po zaniku HBeAg.

Utrzymuja się 1-2 lat. Są markerem przebytego stosunkowo niedawno
WZW typu B.
·

Anty-HBs

Pojawiaja się do kilku miesięcy po zaniku HBsAg. Ich

pojawienie się świadczy o

pełnej serokonwersji

i wyeliminowaniu wirusa z

ustroju. Utrzymują się kilkadziesiat miesiecy. Oznaczają odporność na
zakażenie HBV. Najczulsze znaczniki replikacji wirusa to DNA-HBV oraz
aktywność pDNA-HBV. Pojawiają się w surowicy w okresie poprzedzającym
objawy kliniczne i zanikaja wraz z HBeAg.

Badania molekularne i serologiczne

wykorzystywane w diagnostyce zakażenia wirusem

zapalenia wątroby typu B

zwiększona aktywność ALAT

wykonać oznaczenie anty-HCV

anty- HCV obecne

anty HCV nieobecne

PCR

brak HCV

obecne HCV

PCR

gdy istnieje ryzyko zakażenia

lub pacjent w immunosupresji

okresowa

kontrola

ALAT

i HCV RNA

brak HCV

obecne HCV

Jeżeli ALAT

podwyższone >6 miesiecy

Przewlekłe zapalenie wątroby typu C

poszukiwanie

innych

przyczyn

choroby

wątroby

Algorytm diagnostyczny przy podejrzeniu przewlekłego

wirusowego zapalenia wątroby wywołanego przez

HCV

Diagnostyka molekularna zakażeń wirusami hepatotropowymi

Dotychczas zidentyfikowano sześć rodzajów

wirusów wywołujących zapalenie wątroby;
wirus A, B, C, D, E i niedawno odkryty wirus
G.

Diagnostyka molekularna dotyczy przede wszystkim

zakażeń wirusami typu B i C. Należy przypuszczać, iż
w najbliższym czasie pojawią się testy na wykrywanie
zakażeń wirusem G.

Metoda PCR ma duże znaczenie w wykrywaniu zakażeń

wirusem typu C. Wiadomo bowiem, że testy ELISA
wykrywają jedynie przeciwciała anty-wirusowe.
W przypadku tego wirusa okres okienka serologicznego
może być jednak bardzo długi. Ponadto nie u wszystkich
chorych powstają specyficzne przeciwciała, a testy ELISA
nie są wystarczająco pewne. Istnieje zatem znaczna liczba
pacjentów zakażonych, u których nie wykrywa się
przeciwciał anty-HCV. Dlatego istnieje potrzeba
potwierdzania zakażeń testem RT-PCR

Diagnostyka molekularna zakażeń wirusami hepatotropowymi

Test RT-PCR na obecność wirusa C polega na

amplifikacji fragmentu materiału genetycznego
wirusa. RNA wirusa jest izolowany z surowicy lub
bioptatu wątroby. Amplifikacji jest poddawany
najczęściej najmniej zmienny fragment RNA wirusa,
znajdujący się w tzw. niekodującym odcinku 5' RNA.
Na pierwszym etapie, podczas reakcji odwrotnej
transkrypcji (RT) jest syntetyzowany cDNA wirusa,
który następnie jest poddawany amplifikacji
podczas PCR. Z reguły po RT-PCR, obejmującej
około

30-40

cykli,

wykonuje

się

reakcję

wzmacniającą, tzw. wewnętrzny PCR. Reakcja taka
jest niezbędna, gdyż zawartość RNA wirusa C w
surowicy jest często niska i nie uzyskuje się po RT-
PCR wystarczającej ilości produktu, by można go
było zobaczyć po elektroforezie w żelu agarozowym.
Niektóre testy polegają na wykonaniu tylko jednej
tury amplifikacji, po której wykrywa się produkty,
wykonując

hybrydyzację

ze

znakowanymi

sondami.

Diagnostyka molekularna zakażeń wirusami hepatotropowymi

Dzięki testowi RT-PCR możliwe staje się wykrywanie zakażeń

HCV u osób, u których inne badania diagnostyczne nie dały
pewnych

wyników.

Test

RT-PCR

jest

niezbędny

do

diagnozowania wątpliwych przypadków zapalenia wątroby.

Test RT-PCR umożliwia również określenie,

jaki genotyp wirusa

występuje u badanego pacjenta. Opracowane zostały proste i
szybkie, aczkolwiek kosztowne testy pozwalające określić

sześć

głównych genotypów HCV

. Należy się jednak zastanowić nad

zasadnością wykonywania takich badań przed rozpoczęciem terapii
interferonem. Istnieją rzeczywiście pewne dane wskazujące, że
niektóre genotypy HCV są bardziej oporne na leczenie
interferonem. Nadal jednak nie wiadomo, czy efekt ten jest zależny
jedynie od genotypu wirusa, czy od ilości wirusa w organizmie
chorego, czy też ilość wirusa zależy od rodzaju genotypu. Pewna
grupa pacjentów zakażonych HCV o domniemanej wyższej
odporności na interferon poddaje się jednak leczeniu. Należy
zatem zalecać, by genotypowanie wirusa wykonywać dopiero po
kilku miesiącach terapii, równocześnie z testem ilościowej PCR,
który pozwoli ocenić, czy leczenie jest skuteczne.

Diagnostyka molekularna zakażeń wirusami hepatotropowymi

Zgodnie z najnowszymi zaleceniami w przypadku

rozważania

leczenia

przeciwwirusowego

obowiązkowymi testami jest poziom HCV surowicy,
ocena genotypu wirusa. Wynik tego badania, czyli
rodzaj genotypu, wpływa na czas terapii (24 lub 48
tyg.). Na przykład zakażeni HCV genotypem 1, 4, 5
lub 6 powinni mieć oznaczenie wielkości wiremii
przed włączeniem terapii przeciwwirusowej, gdyż
zalecana jest dłuższa 48-tygodniowa terapia.
Kolejne badanie ilościowe HCV-RNA wykonuje się do 12
i po 24 tygodniach leczenia. Jedynie w przypadkach
genotypu 2 i 3 oznaczenia ilościowe nie są
restrykcyjnie wymagane, a leczenie trwa 24
tygodnie, gdyż wirusa o tym genotypie łatwiej jest
wyeliminować.

Diagnostyka molekularna zakażeń wirusami hepatotropowymi

Mimo iż diagnostyka zakażeń HBV jest lepiej rozwinięta

niż HCV, to jednak stosowanie testów PCR jest przydatne ze
względu na ich wysoką czułość i specyficzność. Wykrywanie
HBV polega na amplifikacji fragmentu jego DNA i możliwe
jest dzięki tej metodzie określenie, z jakim szczepem wirusa
mamy do czynienia.

Nowością w zakresie diagnostyki genetycznej stosowanej

w zakresie infekcji wirusem HBV jest wykrywanie mutacji
wirusa odpornych na działanie leku przeciwwirusowego-
lamiwudyny. Ponieważ w wielu przypadkach po pewnym
czasie stosowania leku (po roku leczenia lamiwudyną u
około 16-32% zakażonych HBV-DNA rozwija mutację YMDD)
WZW B uodparnia się na jego istnienie stąd konieczne jest
wykonywanie do wykonywania badań mających na celu
wykrycie mutacji wirusa (genotypowanie) odpowiedzialnych
za rozwijającą się w trakcie leczenia lekooporność.

Niealkoholowe stłuszczeniowe

zapalenie wątroby (nonalkoholic

steatohepatitis – NASH)

NASH rozpoznajemy tylko u osób, które nie
nadużywają alkoholu.

Częstość występowania choroby alkoholowej wątroby wzrasta
dopiero przy częstym przekraczaniu pewnego „progu” spożycia
alkoholu (tj. 20 g etanolu na dobę u kobiet i 80 g etanolu na
dobę u mężczyzn).
Testy powszechnie stosowane w celu wykrycia nałogowego
picia alkoholu np.

wzrost aktywności aminotransferaz

wzrost aktywności GTP

zmiana średniej objętości krwinki czerwonej
mogą być zmienione przez samą chorobę wątroby i wówczas
oceniane spożycie alkoholu może być zawyżone.
1.Częściowo desialylowana transferyna (partially desialylated
transferrin, dTf)
2.Stosunek dTf/Tf (transferyna całkowita) prawdopodobnie
najlepiej odzwierciedla przewlekłe nadużywanie alkoholu
(czułość 81%, swoistość 98%).
Biopsja wątroby pozostaje najlepszym badaniem
diagnostycznym dla potwierdzenia klinicznego.