Dr inż. Szymczak Barbara
[e-mail]

Tel. Kom. 503 849 129 Katedra 091 449 65 43

Ćwiczenie 1. dnia 3.10.2009 r.

Temat: Ocena jakości mikrobiologicznej mlecznych napojów fermentowanych dostępnych na rynku polskim - posiewy w kierunku ogólnej liczby bakterii fermentacji mlekowej i Bifidobacterium sp.

Materiał badawczy:

Jogurty i kefiry probiotyczne

Podłoża bakteriologiczne:

MRS Agar do oznaczania ogólnej liczby bakterii fermentacji mlekowej

Agar M17 do oznaczania Bifidobacterium sp.

Kierunek oznaczeń:

- określenie ilości bakterii fermentacji mlekowej

-określenie ilości Bifidobacterium sp.

Metody:

Posiewy metodami płytkowymi zalewanymi z nawarstwieniem

Schemat postępowania:

1. Do przygotowanego podłoża Agar M17 dodać antybiotyk 3 ml/1000 ml podłoża i wodny roztwór chlorku litu 10 ml/1000 ml podłoża.

2. Przygotowanie naważki.

3. Wykonanie kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych.

4. Posiewy z kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych na puste jałowe płytki Petriego wcześniej oznakowane (kierunek, grupa, stanowisko, rozcieńczenie, nr próby).

5. Zalanie posiewów ostudzonym do około 40°C podłożem MRS Agar i Agar M17.

6. Po zastygnięciu wykonanie nawarstwienia.

7. Po zastygnięciu płytek inkubacja 48 h/ 30°C.

Odczyt i interpretacja wyników na następnych ćwiczeniach.

Zagadnienia do przygotowania:

-charakterystyka bakterii fermentacji mlekowej

Bakterie fermentacji mlekowej (LAB, ang. Lactic Acid Bacteria)

• gramdodatnie

• beztlenowe bądź względnie beztlenowe

• katalazoujemne

• nie zawierają enzymów cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego, a energię uzyskują na drodze fosforylacji substratowej

• nieprzetwarnikujące

• nieurzęsione

• pH 5,5-5,8 i niższe

Naturalnym środowiskiem występowania bakterii fermentacji mlekowej jest mleko, rośliny, a także błony śluzowe oraz przewód pokarmowy człowieka i zwierząt.

Bakterie fermentacji mlekowej różnią się:

1. ilością produkowanego kwasu mlekowego zależnie od gatunku od 0,6 do 3%;

2. tolerancją na niskie pH środowiska;

3. optymalnymi temperaturami rozwoju;

4. sposobem metabolizowania cukru;

5. środowiskiem bytowania.

Paciorkowce 25°C do 1% kwasu mlekowego

mleko: Streptococcus lactis, S.cremoris środowisko roślinne: Streptococcus diacetylactis, L.citrovorum

Pałeczki 35°C do 2% kwasu mlekowego mleko:

Lactobacillus casei środowisko roślinne: Lactobacillus casei, środowisko roślinne: Lactobacillus

plantarum, Lactobacillus brevis

Pałeczki i paciorkowce termofilne 45°C-50°C do 3% kwasu mlekowego mleko: L.bulgaris,L.helveticus, L.thermophilus środowisko roślinne: L.delbrueckii, Streptococcus thermophilus

- Podział bakterii fermentacji mlekowej ze względu na wymagania temperaturowe:

-mezofile - optymalna temp.20-28°C, produkcja do 1,5% kwasu mlekowego;

Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc.

-termofile - optymalna temp. 40-45°C, produkcja do 3% kwasu mlekowego;

Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus thermophilus

- Podział bakterii mlekowych ze względu na szlaki przemian cukrów:

-homofermentatywne (produkt końcowy: kwas mlekowy)

(Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus).

-heterofermentatywne (produkt końcowy: kwas mlekowy, kwas octowy i alkohol etylowy)

(Leuconostoc, niektóre z rodzaju Lactobacillus, np.:Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum).

Bakterie pseudomlekowe (Micrococcus i Microbacterium)

np.: Bacterium gracile, Bacterium mannitopeum- biologiczne odkwaszanie wina; zmętnienie, nieprzyjemny zapach i smak

Żywność probiotyczna, prebiotyczna i synbiotyczna jest rodzajem żywności funkcjonalnej.

Żywność FOSHU jest normalną żywnością, z której usunięto szkodliwe składniki (np. alergeny), bądź wzbogacono w substancje aktywne fizjologicznie, tak aby otrzymać produkt posiadający odpowiednią wartość odżywczą i podnoszący kondycję człowieka. Jest to Żywność podobna wyglądem do żywności tradycyjnej i przeznaczona do konsumpcji jako część normalnej diety.

Prebiotyki

Składniki żywności nie ulegające strawieniu przez enzymy jelitowe i które mogą korzystnie oddziaływać na organizm człowieka na drodze selektywnej stymulacji w okrężnicy, wzrostu i/lub aktywności jednego lub określonej liczby gatunków (szczepów) korzystnych dla zdrowia gospodarza bakterii.

Kryteria jakie muszą spełnić substancje prebiotyczne.

1. Nie mogą być hydrolizowane, ani wchłaniane w górnych odcinkach przewodu pokarmowego,

2. Muszą podlegać selektywnej fermentacji przez potencjalnie korzystne bakterie, bytujące w jelicie grubym, Muszą korzystnie modyfikować układ mikroflory jelita grubego.

3. Uzyskany efekt musi być korzystny dla zdrowia gospodarza

Synbiotyki

Mieszanina probiotyków i prebiotyków korzystnie wpływających na zdrowie człowieka poprzez poprawę przeżywalności i kolonizacji żywych mikroorganizmów w przewodzie pokarmowym, osiągniętą na drodze selektywnej stymulacji ich wzrostu i aktywności.

-definicja: probiotyki, LAB

Probiotyki

Żywe lub pozostające w stanie anabiozy kultury z rodzaju Lactobacillus, Propionibacterium, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus i Leuconostoc oraz niektóre grzyby Aspergillus i drożdże, głównie z rodzaju Saccharomyces, Candida, zdolne do trwałego zasiedlania organizmu lub przechodzenia w stanie żywym

przez przewód pokarmowy.

- Warunki, jakie powinny spełniać szczepy probiotyczne

-szczep jednoznacznie saprofityczny,
- zdolny do przeżycia niekorzystnych warunków panujących w przewodzie pokarmowym (niskie pH, sole żółciowe),
- zdolny do produkcji egzogennych substancji w organizmie konsumenta
- charakteryzuje się aktywnością antagonistyczną w stosunku do mikroflory patogennej i toksynotwórczej,

- Znaczenie bakterii fermentacji mlekowej

1. Antagonizm w stosunku do patogenów człowieka

2. Znoszenie nietolerancji laktozy

3. Działanie antycholesterolowe

4. Aktywność antynowotworowa

5. Działanie immunomodulacyjne

6. Działanie antyalergiczne

7. Zapobieganie osteoroporozie

8. Zapobieganie próchnicy

Aby bakterie zaliczyć do probiotyków powinny one odznaczać się:

Metody posiewów płytkowych do przypomnienia z drugiego roku

1. Zdolnością do zasiedlania i namnażania w przewodzie pokarmowym;

2. Synteza substancji antybiotycznych;

3. Odpornością na niskie pH i Ŝołć;

4. Aktywowaniem systemu immunologicznego;

5. Zdolnością usuwania mikroflory patogennej z przewodu pokarmowego;

6. Powodować wzrost odporności na kolonizację przewodu pokarmowego przez mikroflorę chorobotworczą.

Metody określania liczebności drobnoustrojów w żywności ?

Do metod oznaczanie liczby organizmów w dowolnym środowisku zalicza się metody:

konwencjonalne, bezpośrednie i pośrednie metody określania liczby w lm l/g/cm

metody szybkie-pośrednie- określające między innymi liczebność drobnoustrojów na podstawie zmian chemicznych - poziomu ATP, zmętnienia, przywodności elektrycznej pożywki tj. zmian zachodzących w środowisku , w wyniku wzrostu w nim drobnoustrojów.

Metody b. pośrednie polegają na bezpośrednim liczeniu odpowiednio przygotowanego materiału pod mikroskopem, różnice między metodami mikroskopowymi określania liczby sprowadzają się do różnych sposobów przeliczenia liczby komórek widzianych pod mikroskopem na jednostkę masy, objętości lub powierzchni

Do tej grupy metod należą:

l. bezpośrednie liczenie w preparacie barwionym

określenie liczby komórek 1g/ml

określenie liczby komórek/l cm preparatu odciskowego Do materiału o konsystencji tkanki

2. Liczenie żywych komórek wybarwionych lub nie barwionych komórek przy pomocy różnego komór, np.: komory Thoma, Burkera Do większych komórek np. komórek drożdży

3. Metoda filtrów membranowych

Metody pośrednie - w tej grupie metod od momentu przeprowadzenia analizy do czasu uzyskania wyników musi minąć czas potrzebny dla uzyskania widocznego wzrostu oznaczanych drobnoustrojów ( czas inkubacji), czas ten zależy od l generacji oznaczanego mikro org. l może się wahać od 24 k do kilkunastu dni

Do tych metod zaliczamy:

M. płytkowa

M. miana

M.NPL

M. spektrofotometryczna

Ad l ).Metoda płytkowa dzieli się na metodę posiewów powierzchniowych, zalewanych, filtrów membranowych. Punktem wyjścia do posiewów jest przygotowanie kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych wyjściowego materiału

Ad 2). Miano jest to najmniejsza ilość badanego materiału, w której znajduje się przynajmniej jeden interesujący nas drobnoustrój. Im wartość miana jest wyższa tym materiał zawiera mniej drobnoustrojów. Np. miano l oznacza, że w l ml badanej próbki jest co najmniej jeden drobnoustrój a np. 100 że w 100 ml jest jeden drobnoustrój.

Ad 3). NPL - najbardziej prawdopodobna liczba, jest to metoda statystyczna, posiew jest wykonywany na podłoże płynne, należy go wykonać w przynajmniej 3 rozcieńczeniach.

Ćwiczenie 2.

Temat: Antagonizm bakteryjny i przykłady.

Formy współżycia pomiędzy drobnoustrojami

• synergizm/symbioza - współdziałanie:

wzrostowy, toksyczny, zakaźny

• antagonizm/antybioza - walka o tlen, składniki odżywcze, produkcja antybiotyków, bakteriocyn, toksycznych katabolitów (H2S)

• Symbioza - to współżycie dwóch lub więcej gatunków organizmów w trakcie, którego każdy lub, co najmniej jeden z parametrów odnosi korzyść a pozostałe nie przynoszą strat np.: współżycie bakterii Nitrosomonas i Nitrosobacter

• Synergizm -jest rodzajem współżycia dwóch organizmów prowadzących do takiej zmiany środowiska, której żaden z parametrów oddzielnie spowodować nie może. Najbardziej znane przykłady oddziaływania synergistycznego polegając na fermentacji cukrów do kwasów i gazów przez bakterię w hodowlach mieszanych. Metabioza - polega na następstwie gatunków w danym środowisku drobnoustroje rosnące w pierwszej kolejności niejako przygotowują warunki do wzrostu następnych np.: w stogu siana lub nawozie naturalnym najpierw rozwijają się mezofile, później, gdy temp. otoczenia wzrasta termofile.

Antagonizm-oddziaływanie pomiędzy drobnoustrojami, z których jeden z nich zmienia środowisko, na hamujące wzrost innych (Thiobacillus thiooxidans) Antybioza-polega na wydzielanie przez niektóre bakterie właściwe, promieniowce i grzyby antybiotyków działających zabójczo lub hamujących wzrost innych drobnoustrojów. Zjawisko antybiozy ma szczególne znaczenie we wzajemnych stosunkach drobnoustrojów glebowych, ponieważ liczni nich przedstawiciele charakteryzują się zdolnością do wytwarzania antybiotyków (Pseudomonas aeruginosa)

1. Na czym polegają metody: słupkowa i studzienkowa?

2. Znaczenie bakterii fermentacji mlekowej.

Na każdym stanowisku:

Płytka ze szczepem wzorcowym:

1. Escherichia coli

2. Staphylococcus aureus

3. Salmonella enteritidis

4. Klebsiella oxytoca

5. Listeria monocytogenes

Hodowla bakteryjna ze szczepem wzorcowym:

1. Escherichia coli

2. Staphylococcus aureus

3. Salmonella enteritidis

4. Klebsiella oxytoca

5. Listeria monocytogenes

Jałowe płytki Petriego

Pipeta z końcówkami jałowymi

Eza bakteriologiczna

Marker do płytek

Metoda słupkowa

Kolejność postępowania:

1. Przygotować 40 ml agaru odżywczego, wysterylizować, a następnie dodać 40µl hodowli bakteryjnej i rozlać na dwie płytki Petriego.

2. Po zastygnięciu podłoża nałożyć wycięte korkoborem krążki ze szczepami probiotycznymi (5 różnych krążków).

3. Próby inkubować 48h/ 34°C.

Metoda studzienkowa

Kolejność postępowania:

1. Przygotować agar odżywczy, wysterylizować i rozlać na płytki Petriego.

2. Wyciąć sterylnym skalpelem „ studzienkę”, do której następnie wlać ostudzony agar MRS ze szczepem probiotycznym. Inkubacja 24 h/34°C

3. Wykonać posiewy kreskowe szczepów wzorcowych z agaru odżywczego

4. Inkubacja 48h/34°C.

5. Odczyt na kolejnych ćwiczeniach.

Odczyt z poprzednich ćwiczeń:

Obliczenie ogólnej liczby bakterii fermentacji mlekowej (Agar MRS) i Bifidobacterium sp. (Agar M17).

- Obliczenie wzrostu wszystkich kolonii na płytkach.

- Podstawienie do wzoru Farmiloe.

LICZBA jtk/g=

N1 - suma kolonii z wszystkich płytek pierwszego liczonego rozcieńczenia
N2 - suma kolonii z wszystkich płytek drugiego liczonego rozcieńczenia
n1 - liczba płytek liczonych z pierwszego liczonego rozcieńczenia
n2 - liczba płytek liczonych z drugiego liczonego rozcieńczenia
R1 - rozcieńczenie pierwsze (liczone)
R2- rozcieńczenie ostatnie (liczone)
 a= R2 : R1
a-współczynnik rozcieńczenia

- porównanie wyników uzyskanych w przypadku pozostałych mlecznych napojów fermentowanych i wyciągnięcie wniosków

- oglądanie preparatów mikroskopowych (szczepy wzorcowe bakterii fermentacji mlekowej).

Podstawy Biotechnologii laboratoria 2009r.

1

---