Wykład IV – 19.11.2011

NOWOTWORY PIERSI

• Najczęstsze nowotwory wśród kobiet, 22% wszystkich nowotworów

• Dominująca przyczyna zgonów u kobiet (po raku płuc), 15% ogółu zgonów

• Dwa typy nowotworów piersi

  • Sporadyczny (90-95%)

  • Dziedziczny (5-10%: min BRCA1, BRCA2, ATM)

• Ponad połowa dziedzicznych przypadków raka sutka jest związana z mutacjami w genach BRCA1 i BRCA2

GENY BRCA1 I BRCA2 – GENY SUPRESOROWE

• BRCA1 – lokalizacja na 17q21, mutacje w genie (ponad 600) wiążą się z dziedzicznymi nowotworami sutka, jajnika, gruczołu krokowego i trzustki

• Ryzyko dla nosicielek mutacji BRCA1: 35%--50% dla raka sutka i 15% dla raka jajnika

• BRCA2 – lokalizacja na chromosomie 13q, ponad 450 zidentyfikowanych mutacji, białko spełnia podobne funkcje jak BRCA1, dwie zmutowane kopie genu (homozygota) są przyczyną anemi Fanconiego (gen FAND1)

• Ryzyko dla nosicielek mutacji BRCA2 20%-35% dla raka sutka i 15%-30% dla raka jajnika

• Komórki z mutacjami w genie BRCA1 i BRCA2 (homozygoty) mają upośledzoną naprawę przez hiomologiczna rekombinację HR niestabilność genomu i niekontrolowana proliferacja komórek

U heterozygot w tych genach obserwuje się haploinsuficjencję.

ROLA GENÓW BRCA1 i BRCA2

• Naprawa DNA (naprawa DSB – HR) kompleks BRCA1/PALB2/BRCA2 i Rad51 (PALB2 – białko łacznikowe)

BRCA1/CtIP/kompleks MRN – decyduje jaką droga zostanie usunięte uszkodzenie

• Regulacja transkrypcji

• Regulacja cyklu komórkowego; największa aktywność w fazie S cyklu komórkowego

• Konieczne w rozwoju organizmu

INHIBITORY PARP W LECZENIU RAKA U PACJENTÓW Z MUTACJAMI W BRCA

IN VITRO

• Komórki homozygotyczne z mutacjami w BRCA1 lub BRCA2 100 – 1000 razy bardzie wrażliwe na inhibitory PARP niż heterozygoty i dzikie komórki. (Tylko BRCA1 posiada aktywność enzymatyczną)

• Heterozygoty i komórki typu dzikiego nie reagują na PARP

POLI(ADP-RYBOZO)POLIMERAZA (PARP)

• PARP – rodzina 18 enzymów katalizujących reakcję przyłączania negatywnie naładowanych cząsteczek poli (ADP-rybozy) do białek, substratem tej reakcji jest NAD+ (mono-, poliADP-rybozylacja)

• Przyłączanie polimerów PAR uaktywnia białka, zaangażowane w różne procesy, takie jak np.:

  • Modyfikacja chromatyny

  • Naprawa pęknięć DNA

  • Apoptoza

  • Metabolizm energetyczny

  • Regulacja transkrypcji

  • Stabilizacja genomu

INHIBITORY PARP

• Pierwsze inhibitory: analogi nikotynamidu; 3-aminobenzamid (3-AB) zwiększenie efektu genotoksycznego czynników metylujących w białaczkach u gryzoni

• Te wyniki zasugerowały, że inhibitory PARP mogą być wykożystane w terapii antynowotworowej.

PARP I NAPRAWA DNA

PARP – poli(ADP-rybozo) polimeraza, enzym katalizujący rybozylację – potranslacyjną modyfikaję białek

BER - XRCC1, DNA ligaza III, polimeraza ε DNA, polimeraza β DNA

Mysie mutanty PARP1 -/- żyją, ale są bardzo wrażliwe na czynniki alkilujące i promieniowanie jonizujące, a paradoksalnie są odporne na różne patofizjologiczne zjawiska, jak np. sceptyczny szok lipopolisacharydowy.

INHIBITORY PARP

• Brak prawidłowego działania podczas naprawy pojedynczych pęknięć DNA SSB przez BER prowadzi do ich nagromadzenia

• SSB DSB: podczas replikacji zapadnięte widełki replikacyjne (collapsed replication forks) generują powstawanie podwójnych pęknięć DNA (DSB) z SSB

• DSB są naprawiane przez rekombinacje homologiczną (HR) ale w komórkach niezdolnych do jej przeprowadzenia inhibicja PARP w konsekwencji prowadzi do fragmentacji DNA i śmierci komórki

INHIBITORY PARP W LECZENIU RAKA U PACJENTÓW Z MUTACJAMI W BRCA

• Mechanizm cytotoksyczności indukowanej inhibitPARP(?) – potwierdzenie w badaniach klinicznych

• Wiele innych białek uczestniczy w naprawie DSB – szersza możliwość zastosowania inhibitorów PARPC, nie tylko z mutacjami BRCA

• Inhibitory PARP znacznie poprawiają wynik terapeutyczny

Inhibitory: olaparib, iniparib, rucaparib (II faza)

Iniparib – pierwszy inhibitor PARP zakwalifikowany do III fazy badań klinicznych u kobiet z potrónie negatywnym rakiem piersi (w kombinacji z gemcytabiną i karboplatyną)

FENOTYP KOMÓREK Z NIESPRAWNYM SYSTEMEM HR

• Niestabilny genom

• Podwyższona wrażliwość na czynniki sieciujące DNA (MMC, cisplatyna) i promieniowanie jonizujące

CHOROBY ZWIĄZANE Z HR

Choroba	Gen
AT (ataksja teleangiektazja)	ATM
NB1 (zespół łamliwego Nijmegen)	NBS1
ATLD (zespół podobny do AT)	MRE11
Anemia Fanconiego (grupa D1)	BRCA2
Nowotwory piersi	Heterozygoty dla BRCA1 Heterozygoty dla BRCA2
Anemia Fanconiego	Grupa: D1 – BRCA2 O-RAD51C N-PALB2 P-SLX4

Mechanizmy naprawy DSB

• Homologiczna rekombinacja (HR) – S, G₂

• Łączenie niehomologicznych końców (NHEJ) –G₀, G₁, S, G₂

• Pojedyncze wydłużanie końców (single strand annealing, SSA) - poboczne

Główne białka NHEJ

• Ku70/Ku80
  Zidentyfikowane w surowicy pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi

• DNA-PKcs (PI(3)KK family)/Artemis
  DNA-PKcs – kinaza fosforylująca białka zaangażowane w naprawę; Artemis –endonukleaza
  autofosforylacja, fosforylacja Artemis

• XRCC4/Ligaza 4

• Cernunnos (XLF)

Mechanizmy NHEJ

Aya KUROSAWA, Noritaka ADACHI, 2010, Functions and Regulation of Artemis: A Goddess in the Maintenance of Genome Integrity

Regulacja białka Artemis (aktywność egzonukleazy) w NHEJ

• Autofosforylacja DNA – PKcs (rekrutuje Artemis do miejsc występowania DSB)

• Fosforylacja Artemis przez DNA-PKcs

• Zmiany konformacyjne Artemis

• Powstawanie aktywnej formy Artemis, przygotowanie końców DNA do ligacji przez ligazę DNA IV

Artemis jako „downstream” – czynnik w ścieżce sygnalizacyjnej ATM

• ATM fosforyluje Ser 645 w Artemis w odpowiedzi na uszkodzenia DNA

• Ufosforylowany Artemis fizycznie łączy się z kompleksem MRE11/Rod50/Nbs1 i uczestniczy w regulacji progresji cyklu komórkowego

Rola NHEJ

• Naprawa DSB indukowanych przez IR

• V(D)J – rekombinacja synteza przeciwciał

• Utrzymanie telomerów

Rola NHEJ – rekombinacja V(D)J
Rysunek z: Schatz DG, Ji Y, 2011, Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination,

• V(D)J powstawanie funkcjonalnych genów kodujących fragmenty zmienne łańcuchów immunoglobulin oraz receptorów komórek T (TCR)

• DSB wprowadzone w segmentach genowych – występuje w wielu kopiach, funkcjonalny gen : po 1 kopii segmentu VDJ

  • zmienne V (variable)

  • różnicowanie D (diversity)

  • łącznikowe J (joining)

SCID – Severe Combined Immune Deficiency, ciężki złożony niedobór odporności

• 1:500 000

• Zablokowanie rozwoju komórek T (kliniczny fenotyp)

• Brak lub obecność funkcjonalnych komórek B i NK (immunologiczna klasyfikacja)

• Zaburzenia odpowiedzi komórkowej i humoralnej

• Śmierć w ciągu pierwszego roku życia spowodowana niedoborem immunologicznym

  • defektywna rekombinacja V(D)J – zaburzenia składania genów, przeciwciał i receptorów komórek T -> niefunkcjonalne limfocyty T i B, komórki NK

  • defektywna naprawa DSB - > dodatkowo wrażliwość na promieniowanie jonizujące

• defektywna rekombinacja VDJ – uszkodzenia w powstaniu genów przeciwciał i receptorów komóek T niefunkcjonalne limfocyty T i B

• defektywna naprawa DSB dodatkowa wrażliwość na promieniowanie jonizujące