ĆWICZENIE 5
BIOLOGICZNE PROCESY ROZKŁADU MATERII ORGANICZNEJ. BIOLOGICZNE OCZYSZCZANIE ŚCIEKÓW. KOMPOSTOWANIE.
Literatura zalecana:
1. Schlegel G. Hans: Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000, str.
500-535.
2. Duvigneand Paul: Biosfera jako środowisko człowieka, str. 91-96
Zagadnienia szczegółowe:
- Znajomość pojęć: biodegradacja, biokumulacja, enzymy adaptacyjne, kometabolizm, ksenobiotyk.
- Rozkład substancji naturalnych: celuloza, ksylan, skrobia, pektyny, chityna, lignina,
węglowodory, białka.
- Rozkład syntetycznych związków organicznych: chlorowcowane fenole, detergenty.
- Mikrobiologiczne przemiany metali ciężkich.
- Czynniki wpływające na podatność substancji organicznych na rozkład biologiczny.
Zadanie 1.
Rozkład fenolu przez drobnoustroje wyizolowane z wody powierzchniowej oraz przez szczep
bakterii Psedomonas fluorescens.
Materiały:
Zawiesina drobnoustrojów wyizolowanych z wody powierzchniowej oraz szczepu bakterii
Psedomonas fluorescens, kolby płaskodenne z podłożem minimalnym 80 cm3, 0,1% roztwór fenolu,
kolbki miarowe o pojemności 50 cm3, bufor fosforanowy, roztwór 4-aminoantypiryny, roztwór
żelazicyjanku potasowego.
Wykonanie:
Do kolby płaskodennej o objętości 250 cm3 zawierającej 80 cm3 sterylnego podłoża minimalnego
dodać sterylnie 10 cm3 0,1% roztworu fenolu i zaszczepić drobnoustrojami wyizolowanymi z wody
powierzchniowej oraz bakteriami Psedomonas fluorescens. Jednocześnie przygotować zestaw
kontrolny zawierający sterylne podłoże minimalne i fenol w takiej ilości jak w próbie zaszczepionej
bakteriami. Kolby ustawić na wytrząsarce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 72 h. Po
tym czasie pobrać 10 cm3 hodowli, odwirować przez 10 minut z prędkością 10 tys. obr./min i
oznaczyć zawartość fenolu w 1cm3 supernatantu. Jednocześnie oznaczyć zawartość fenolu w próbce
kontrolnej.
Oznaczanie fenolu – metoda 4-aminoantypirynowa:
Fenole lotne z parą wodną reagują przy pH=4 w obecności żelazicyjanku potasowego z 4-
aminoantypiryną tworząc pochodne indofenolowe o zabarwieniu od żółtego do czerwonego, w
zależności od stężenia fenolu.
Do kolbki miarowej o poj. 50 cm3 wprowadzić 1 ml badanej próby, dodać 20 ml buforu
fosforanowego (pH=7,9), dobrze wymieszać. Następnie dodać 0,5 ml r-ru 4-aminoantypiryny,
dobrze wymieszać. Dodać 0,5 ml r-ru żelazicyjanku potasowego, dobrze wymieszać. Po 15
minutach odczytać absorpcję przy długości fali 500 nm względem próby kontrolnej. Określić
stężenie fenoli w próbce z krzywej wzorcowej.
Sporządzenie krzywej wzorcowej.
Do kolejnych czterech kolbek miarowych o poj. 50 ml wprowadzić 1, 2, 5, 10 ml roztworu fenolu
zawierającego w 1ml 0,01 mg fenolu (100-krotnie rozcieńczony 0,1% r-r fenolu). Dalej postępować jak
podano wyżej przy oznaczaniu fenoli w badanej próbce. Odczytać absorpcję kolejnych wzorców i
sporządzić krzywą wzorcową.
Zadanie 2.
Obserwacja rozkładu celulozy przez organizmy glebowe i osadu dennego
Materiały:
Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, krążki bibuły, pojemniki na glebę, duże szkiełka
zegarkowe.
Wykonanie:
1. Napełnić pojemniki do połowy badaną glebą;
2. Położyć na powierzchnię podłoża krążek bibuły (celuloza) i zwilżyć go wodą;
3. Przykryć szkiełkiem zegarkowym;
4. Analogicznie nastawić próbę kontrolną z podłożem wyjałowionym w wysokiej temperaturze.
Obserwować powierzchnię krążków przez okres paru tygodni. Zwrócić uwagę na pojawiające się
plamy o różnym zabarwieniu i powstające w ich miejscu ubytki.
Porównać intensywność rozkładu celulozy na różnych podłożach i w próbach kontrolnych.
Zadanie 3.
Obserwacja rozkładu wybranych materiałów tekstylnych w środowisku glebowym.
Materiały:
Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, próbki tkanin, pojemniki na glebę.
Wykonanie:
1. Wprowadzić do każdej z gleb badany materiał i przetrzymać przez kilka tygodni;
2. Utrzymać wilgotność prób przez skrapianie wodą;
3. Po kilku tygodniach obserwować zmiany na powierzchni tkanin i porównać wyniki.
Zadanie 4.
Rozkład drewna i celulozy przez grzyby pasożytujące na drzewach.
Materiały:
Zawiesina grzybni korowicy (Phanerochete sp.), pożywka mineralna o pH=4,5, krążki bibułowe,
kawałki drewna, kolby stożkowe.
Wykonanie:
Rozkład drewna
1. Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką zawierającą drewno ok. 0,5 ml zawiesiny grzybni;
2. Przygotować próbę kontrolną przez wprowadzenie 0,5 ml zawiesiny do pożywki nie zawierającej
drewna;
3. Inkubować w temp. 37oC;
4. Obserwować wzrost grzyba w obu próbach.
Zmiany w drewnie powodowane przez grzyb mogą być widoczne gołym okiem dopiero po dłuższym
czasie biodegradacji, ze względu na obecność w drewnie trudno rozkładalnych substancji ligninowych
(osłaniających celulozę). Dlatego o dokonującym się procesie rozkładu można tu wnioskować
pośrednio, np. na podstawie wzrostu grzybni. Porastanie przez grzyb drewna świadczy o procesie jego
rozkładu, gdyż w pożywce nie ma innych źródeł węgla. Ewentualny ograniczony wzrost w próbie
kontrolnej, może wynikać z wprowadzenia niewielkich ilości związków organicznych wraz z
inokulum.
Rozkład celulozy
1. Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką mineralną krążek celulozowy;
2. Zaszczepić pożywkę inokulum w postaci 0,5 ml zawiesiny grzybni;
3. Przygotować próbę kontrolna (bez grzyba);
4. Inkubować w temp. 37oC;
5. Obserwować przez ok. 3 tygodnie zmiany zachodzące w krążkach badanych i kontrolnych.
Wykonać preparaty mikroskopowe z obu krążków. Zwrócić uwagę na przerośnięcie włókien
celulozowych strzępkami grzybni.