ĆWICZENIE 13

OCENA GENOTOKSYCZNOŚCI ZANIECZYSZCZEŃ

WODY I GLEBY

Zagadnienia szczegółowe:

ryzyko środowiskowe; narażenie środowiskowe; mutagen; ksenobiotyki; genotoksyczność; mutagenność; kancerogenność; teratogenność; rodzaje działania ksenobiotyków; wchłanianie i wewnątrzustrojowe przemiany ksenobiotyków; biologiczne działanie zanieczyszczeń pyłowych, gazowych, metali ciężkich; pierwiastków radioaktywnych i związków organicznych; toksyczne metabolity wewnątrzustrojowe; definicja biotestu; podział biotestów; warunki jakim powinien odpowiadać organizm testowy; testy krótko-
i długoterminowe; klasyfikacja metod oceny mutagenności i kancerogenności; zasada testu Amesa

Literatura zalecana:

• Traczewska T.M. Biologiczne metody oceny skażenia środowiska. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2011, Strony: 38-41, 103-124

• Pawlaczyk-Szpilowa M. Biologia i ekologia. Oficyna Wydawnicza Politechniki

Wrocławskiej, Wrocław 1997, Strony: 351-374

Zadanie 1. Badanie mutagennego działania za pomocą testu Amesa - pokaz

- do sterylnej probówki wlać 0,5 cm³ buforu fosforanowego

- przy pomocy automatycznej mikropipety wprowadzić do probówki 0,1 cm³ całonocnej

bulionowej (bulion Oxoid) hodowli szczepu Salmonella typhimurium

- dodać 0,1 cm³ badanego związku (jedno z trzech stężeń)

- probówkę umieścić w termostacie o temperaturze 37^oC na 20 min. (preinkubacja)

- po preinkubacji dodać 2 cm³ top-agaru, szybko wymieszać a następnie wylać na płytkę

Petriego z podłożem minimalnym i równomiernie rozprowadzić po powierzchni

- postępując w sposób podany wyżej wykonać kontrolę pozytywną dodając zamiast związku

badanego 0,1 cm³ wzorcowego związku mutagennego (uwaga związek silnie mutagenny)

- wykonać kontrolę mutacji spontanicznej postępując jak wyżej jednak bez dodawania

związku badanego, ani wzorcowego związku mutagennego

- wszystkie próby wykonać w trzech powtórzeniach

- płytki inkubować w temperaturze 37⁰C przez 48 h

- po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie na wszystkich płytkach uśredniając

powtórzenia

- ocenić czy badany związek ma właściwości mutagenne

Zadanie 2. Badanie mutagenności wybranych substancji - pokaz

- na podłożu minimalnym posiać dywanowo/powierzchniowo auksotroficzny szczep bakterii

Salmonella typhimurium (tzn. pobrać sterylną końcówką pipety automatycznej 0,1 cm³ zawiesiny bakteryjnej i umieścić na powierzchni podłoża, następnie sterylną głaszczką, ostrożnie i dokładnie rozprowadzić zawiesinę po powierzchni pożywki stałej)

UWAGA: rozwiązanie alternatywne

Wprowadzić na podłoże minimalne 1 cm³ zawiesiny auksotroficznych bakterii Salmonella typhimurium, delikatnie przechylać szalkę Petriego, tak aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę po całej powierzchni. Następnie nadmiar ściągnąć sterylną końcówką przy pomocy pipety automatycznej.

- szalkę Petriego od spodu dna podzielić (pisząc markerem do szkła) na cztery części, jedną

pozostawić na kontrolę, pozostałe trzy opisać zgodnie z zastosowanymi w zadaniu

substancji mutagennymi:

• roztwór popiołu z komina

• oranż akrydyny

• benzo-a-piryn

- na każdej ćwiartce położyć sterylny krążek bibułowy zamoczony wcześniej w roztworze

badanego mutagenu zgodnie z opisem na ćwiartce szalki Petriego, w przypadku kontroli krążek zamoczyć w sterylnym roztworze fizjologicznym

- płytki inkubować 48 godzin w temperaturze 37^oC

- po inkubacji odczytać wyniki: strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka,

świadczący o mutagennym wpływie badanego związku

- wyjaśnić przyczynę wystąpienia strefy zahamowania wzrostu bakterii

---