Ćwiczenie 2

Obserwacja komórek zwierzęcych w mikroskopie świetlnym

Wymagane przygotowanie teoretyczne: ogólna budowa komórek prokariotycznych
i eukariotycznych, zadania.

1. Wprowadzenie do mikroskopii (prezentacja)

budowa mikroskopu, rodzaje mikroskopów

2. Opis komory Bürkera do liczenia komórek w zawiesinie (prezentacja)

3. Barwienie przyżyciowe komórek z hodowli (ćwiczenie wspólne dla całej grupy) częściowo wykonuje prowadzący.

1. Przygotowanie komórek (prowadzacy)

Komórki hodowane in vitro (ustalona linia komórkowa) w butelce do hodowli, przylegające do podłoża. Hodowane w pożywce zawierającej wszystkie niezbędne składniki odżywcze (aminokwasy, witaminy, sole mineralne, glukoza) oraz 10% surowicy płodowej i gentamycynę (antybiotyk przeciwbakteryjny).

• komórki zebrać z butelki hodowlanej za pomocą trypsynizacji (3 ml 0,1% r-ru

trypsyny i 0,05% EDTA w PBS) i przenieść do probówki 15ml

• zneutralizować działanie trypsyny przez dodanie 2 ml podłoża do hodowli komórek

• oszacować pod mikroskopem wymagane rozcieńczenie komórek

B. Barwienie i liczenie komórek w komorze Bürkera:

1. Pobrać z probówki nr 1 30 μl zawiesiny komórek i przenieść do czystej probówki Eppendorfa, dodać 30 μl roztworu błękitu trypanowego wymieszać i nanieść do komory Bürkera z obu stron szkiełka nakrywkowego po 10 μl.

2. Liczyć pod mikroskopem komórki żywe (niewybarwione) i martwe (wybarwione) w 5 kwadratach każdej połowy komory (każdy kwadrat liczy inna osoba). Zapisać wynik.

3. Z probówki nr 2 pobrać 30 μl zawiesiny do nowej probówki i dodać 30 μl r-ru erytrozyny. Liczyć w komorze jak poprzednio.

Liczy się komórki w 5 zaznaczonych kwadratach w każdej z obu części komory

(czyli w 10 kwadratach).

Objętość 1 kwadratu = 0,1 mm³,

objętość 10 kwadratów to 1mm³ (1000 mm³ to 1 ml)

Suma komórek z 10 kwadratów x 1000 daje liczbę komórek w 1 ml badanej zawiesiny

4. Obserwacja komórek utrwalonych i wybarwionych

• na szkielku mikroskopowym (komórki mysiego raka płuca LLC, utrwalone
  w zawiesinie za pomocą mieszaniny metanolu:kwasu octowego 3:1, naniesione
  na szkielko, wybarwione 1% roztworem fioletu krystalicznego

• na płytce hodowlanej (LLC i fibroblasty mysie NIH3T3, utrwalone alkoholem 96% i wybarwione 1% roztworem fioletu krystalicznego)

5. Sprawozdanie:

Wstęp teoretyczny - opis komory Bürkera

Opis doświadczenia - przygotowanie komórek do liczenia w komorze

Wyniki - podać obliczoną ilość komórek żywych i martwych w każdym kwadracie, wyliczyć średnią oraz ilość komórek obu rodzajów na 1 ml zawiesiny dla dwóch barwników. Porównać wyniki odsetek komórek żywych i martwych dla dwóch barwników przyżyciowych.

Wnioski - zapisać, czy występują różnice w odsetku komórek martwych dla obu barwników. Jeśli tak, czym mogą być spowodowane.

1

---