LABORATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

Ćwiczenie nr. 4

Biosynteza proteinazy bakteryjnej w fermentorach

Biotechnologia II grupa

Czwartek 8¹⁵-12^oo

Izabela Jeżyńska

Łukasz Stasiak

Rafał Krawczyk

Data oddania sprawozdania 03.04.2008r

1. Wprowadzenie

Drobnoustroje, które stosowane są do produkcji enzymów mogą być hodowane dwoma metodami:

powierzchniową- na pożywkach stałych lub płynnych w cienkiej warstwie

wgłębną w dużych zamkniętych fermentorach przy intensywnym napowietrzaniu i mieszaniu.

Produkcję dzieli się na 2 etapy: proces biosyntezy enzymu i proces jego wyodrębniania. Biosyntezę prowadzi się przeważnie w oparciu o wgłębną, okresową hodowlę bakterii w klasycznych fermentorach w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie i przy zastosowaniu specyficznych dla każdego szczepu warunków fizycznych i chemicznych. Skład pożywki dobiera się indywidualnie dla każdego gatunku, musi uwzględniać mechanizmy regulacji biosyntezy (represję) oraz być ekonomiczny.

Proteinazy stanowią grupę enzymów proteolitycznych, która katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych oraz estrowych. Proteinazy są nierozerwalnie związane z całym życiem białek. Przetwarzanie białek przez proteinazy powoduje w rezultacie włączenie lub wyłączenie ich aktywności biologicznej. Najlepiej scharakteryzowaną grupą enzymów stanowią proteinazy serynowe. Powodem tego może być ich rola biologiczna oraz fakt, że stanowią one najliczniejszą grupę enzymów proteolitycznych występującą w przyrodzie. Oprócz pożytecznej funkcji proteolizy istnieją również związane z nią niebezpieczeństwa. W związku z powyższym, procesy te muszą być ściśle kontrolowane w określonym czasie i miejscu, tak, aby były pożądane i skuteczne. Jednym z mechanizmów kontroli proteolitycznej jest działanie inhibitorów proteinaz, obecnych we wszystkich znanych organizmach oraz w różnych tkankach tych organizmów.

Subtilizyny- alkaliczne proteinazy pozakomórkowe wytwarzane przez bakterie Bacillus

subtilis.

FERMENTORY

Fermentor (bioreaktor)- urządzenie skonstruowane w sposób umożliwiający kontrolę procesu produkcyjnego i jego optymalny przebieg (pomiar i regulację parametrów) w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń; prowadzone są w nim: procesy mikrobiologiczne, enzymatyczne, jak również hodowle komórek organizmów wyższych; bardzo ważna jest (przy prowadzeniu procesów tlenowych) sprawność w zakresie wymiany masy (tlenu) oraz odprowadzania wydzielającego się ciepła.

W warunkach laboratoryjnych stosuje się różne typy bioreaktorów o pojemności roboczej od kilku ml do kilkunastu litrów, natomiast w warunkach przemysłowych o pojemności od kilkudziesięciu litrów do kilkuset m³.

Bardzo popularne są bioreaktory do procesów wgłębnych zapewniające dobre warunki mieszania i napowietrzania. Jednym z podstawowych problemów technicznych (obok mieszania), który warunkuje efektywną wymianę masy (i szybkość procesu) w bioreaktorze, jest sposób doprowadzenia powietrza do środowiska fermentacyjnego. Najczęściej stosowane są:

1) bełkotka, czyli rura perforowana,

2) dysza strumieniowa,

3) rura lub tarcza porowata (metalowa względnie ceramiczna),

4) mieszadło wyposażone w wirnik zasysający powietrze (doprowadzane np. wydrążonym wałem mieszadła) i wtłaczający je do cieczy.

W bioreaktorze możemy wyróżnić dwa typy mieszania: mikromieszanie i makromieszanie. Mikromieszanie odbywa się na poziomie molekularnym lub bliskim molekularnego (konwekcja) i może być scharakteryzowane przez współczynnik dyfuzji efektywnej. Natomiast makromieszanie rozpatrywane jest na poziomie bioreaktora i dotyczy warunków przepływu (cyrkulacji, przemieszczania się) mieszaniny cieczy, gazu i komórek. Czas wymieszania (czas potrzebny do osiągnięcia jednorodności środowiska po impulsowym zadziałaniu czynnika zewnętrznego) jest parametrem charakteryzującym warunki mieszania w skali całego bioreaktora. Bezpośrednio o warunkach mieszania decyduje szybkości obwodowej mieszadła. Ważnym parametrem technologicznym związanym z mieszaniem w klasycznych bioreaktorach jest szybkość obrotów mieszadła. W pobliżu mieszadła powstaje strefa dobrego wymieszania (mikromieszanie). natomiast w pozostałej objętości bioreaktora mogą tworzyć się strefy o różnych warunkach mieszania cieczy. Wzajemna wymiana substancji pomiędzy tymi strefami zachodzi w wyniku przemieszczania się strumieni cieczy (makromieszanie).

Mieszanie w pierwszym rzędzie musi zapewnić dobre warunki wymiany gazowej (warunki natleniania). Jeżeli są one spełnione, wówczas pozostałe parametry procesu zależne od mieszania, takie jak rozkład stężenia substratów, produktów oraz ich dyfuzja w podłożu, nie stanowią czynników ograniczających szybkość procesu biologicznego lub zakłócających jego przebieg.

Niska rozpuszczalność tlenu w podłożu oraz duża szybkość jego zużywania przez drobnoustroje w procesach tlenowych sprawiają, że zasadniczym problemem w ich prowadzeniu jest zapewnienie dostatecznie szybkiego przenoszenia tlenu z fazy gazowej do komórek. Jeżeli szybkość przenikania tlenu do podłoża jest mniejsza od szybkości jego zużywania przez komórki, wówczas powstają warunki tlenowej limitacji procesu oddychania, wzrostu komórek lub biosyntezy produktu. Wartość stężenia tlenu, poniżej której występują warunki limitacji tlenowej określa się jako stężenie krytyczne. Najczęściej poprawę warunków natleniania hodowli uzyskuje się przez zwiększenie szybkości absorpcji tlenu w podłożu. Jednym z prowadzących do tego celu sposobów jest powiększenie różnicy stężeń tlenu rozpuszczonego w podłożu i zawartego w fazie gazowej przez użycie powietrza wzbogaconego tlenem lub czystego tlenu. Zasadniczym kierunkiem poprawy warunków natleniania są jednak działania inżynieryjne pozwalające na podwyższenie szybkości wnikania tlenu z fazy gazowej do ciekłej. Zwiększenie przepływu powietrza lub szybkości obrotów mieszadła może być stosowane w ograniczonym zakresie, zależnym od właściwości pianotwórczych hodowli. Nadmierne obroty mieszadła mogą powodować mechaniczne niszczenie komórek.

Poważnym problemem jest również piana. Piana to heterogenicznym układem pęcherzyków gazu rozproszonych w malej ilości cieczy. Powstawanie i utrzymywanie się piany uzależnione są od składu i właściwości fizykochemicznych środowiska oraz od intensywności mieszania dwóch faz: gazowej i ciekłej. Substancje pianotwórcze wprowadzane są do środowiska fermentacyjnego w składzie surowców kompleksowych używanych do przygotowania podłoży. W czasie fermentacji skład chemiczny podłoża i jego właściwości fizykochemiczne ulegają zmianie, co w istotny sposób wpływa na pienienie się środowiska. Degradacja i asymilacja składników podłoża, zmiana pH, obniżenie się lepkości i wzrost napięcia powierzchniowego dają w efekcie redukcję pienistości, która po osiągnięciu trwającego krócej lub dłużej minimum, zazwyczaj ponownie wzrasta w końcowej fazie procesu. Przyczyną tego mogą być zarówno ulegające stopniowo rozkładowi składniki podłoża, wydzielane pozakomórkowo produkty metabolizmu użytego drobnoustroju, jak i degradacja składników biomasy zachodząca podczas autolizy komórek. Powstawanie piany i konieczność stosowania środków zapobiegających temu bywa przyczyną szeregu poważnych kłopotów natury technicznej, biologicznej i ekonomicznej:

• wzrost heterogeniczności środowiska

• utrudnienie lub wręcz uniemożliwienie kontroli stężenia składników podłoża oraz objętości hodowli

• zagrożenie wypienienia hodowli z bioreaktora oraz możliwość jego zainfekowania obcą mikroflorą

• obniżenie pojemności użytkowej bioreaktora o 30 — 50%,

• konieczność stosowania odpowiedniego oprzyrządowania przeciwdziałającego pienieniu się hodowli

• przechodzenie śladowych ilości substancji przeciwpianowych do produktów,

• pogorszenie się warunków natlenienia środowiska na skutek wprowadzenia środków przeciwpianowych,

• niekorzystny ich wpływu na morfologię i fizjologię drobnoustrojów.

Efektywność odpieniania zależy od właściwości fizykochemicznych, zarówno

środka przeciwpianowego, jak i substancji pianotwórczych oraz od wzajemnego stosunku ilościowego w układzie. Wprowadzenie środka odpieniającego do hodowli powoduje okresowe pogarszanie się rozpuszczalności tlenu, warunków jego transportu z fazy gazowej do podłoża oraz blokowanie powierzchni komórek drobnoustrojów. Dobór środka przeciwpianowego uzależniony jest od składu podłoża, użytego drobnoustroju i produkowanego metabolitu. Jest on dokonywany doświadczalnie, metodą prób. Oprócz chemicznych mamy również szereg rozwiązań pozwalających na mechaniczne niszczenie piany.

Fermentor zbiornikowy z bełkotką i mieszadłem

Podstawowe elementy budowy tego bioreaktora to: zbiornik, płaszcz grzejny (do niego doprowadzana jest woda lub para), mieszadło (może być zamocowane u góry lub u dołu), elektrody, którymi mierzymy różne parametry (elektrody są umieszczane na poziomie łopatek mieszadła-takie ustawienie elektrod ułatwia ich obmywanie), króciec do odbierania prób (różnie umieszczony), odpieniacz mechaniczny, filtry (wlotowy, wylotowy).

Hodowla w fermentorach

Należy umyć zbiornik, wysterylizować przed hodowlą, wykalibrować elektrody, przygotować sprzęt, wężyki, media sterylizowane w autoklawach, przygotować pokrywę (np. trzeba wiedzieć jaką ilość mediów będziemy dodawać, żeby odpowiednio przygotować określoną ilość otworów w pokrywie). Następnie umieszcza się pożywkę, dodaje do niej, jeśli to konieczne, specjalne (uzupełniające ) składniki, np. odpieniacz oraz doprowadza do odpowiedniego pH. i sterylizujemy w fermentorze w temperaturze 121^oC, pod ciśnieniem 1 atm przez określony czas. Po ochłodzeniu do temperatury hodowli, pH pożywki koryguje się do wskazanej wartości i wprowadzamy inokulum (10-20% objętości fermentora)-luzujemy króciec wlotowy, opalamy zwojem waty nasyconej spirytusem i otwieramy, opalamy szyjkę kolby z inokulum nad palnikiem, wlewamy inokulum do fermentora i natychmiast zamykamy króciec wlotowy (do dużych fermentorów produkcyjnych otrzymanie koniecznej ilości inokulum wymaga kilkuetapowego namnażania: probówka kolbamały fermentor (15dm³)duży fermentor(3m³)główny fermentor produkcyjny ). Podczas hodowli drobnoustrojów tlenowych konieczne jest mieszanie pożywki i ciągłe napowietrzanie przez przepuszczanie pod ciśnieniem sterylnego powietrza. Ilość powietrza, jego dyspersja (wymiary pęcherzyków) regulowana szybkością mieszania pożywki, stosowaniem specjalnych barboterów i przegród decydują często o efektywności całego procesu produkcyjnego. Intensywne napowietrzanie sprzyja pienieniu się pożywki. Fermentory wyposażone są w układ zapobiegający nadmiernemu powstawaniu piany (mechaniczne i chemiczne odpieniacze). Nadciśnienie powietrza lub innego gazu stosuje się w fermentorze by zapobiec przenikaniu do wnętrza niesterylnego powietrza i polepszyć efekty biosyntezy. Podczas prowadzenia hodowli mierzymy różne parametry: pO₂, pH, ilość enzymu, zmętnienie, ilość cukru zużywanego przez drobnoustroje, itp. Parametry te można zmieniać, np. zmienić pH dodając kwasu. W czasie procesu dostarczamy powietrze, niezbędny jest więc filtr wlotowy (aby nie dostało się nic, co by mogło zaszkodzić naszej hodowli). Dostarczane pęcherzyki powietrza (pod łopatkami mieszadła) rozbijają się o mieszadło na mniejsze pęcherzyki. Powstająca piana zaczyna wychodzić przez filtr wylotowy, zapycha go i mogą popękać rurki-dlatego konieczne jest stosowanie odpieniaczy:

• chemicznych-zmniejszają napięcie powierzchniowe cieczy; działa on na powierzchni cieczy, jednak rozpuszcza się on w tej cieczy i nie ma go po jakimś czasie na powierzchni i nie działa wtedy już

• mechanicznych (zbijacz mechaniczny)- w postaci dwóch stożków, które mają na swoim obwodzie płytki, piana jest zbijana, tworzy się ciecz, która zrasza pianę i ta jest zbijana. Przeważnie są montowane w górnej części fermentora.

W fermentorach są czujniki, które informują o wysokim poziomie piany i zostaje uruchomiony wtedy mechaniczny odpieniacz. Jeśli on nie pomoże to zostaje uruchomiony chemiczny odpieniacz.

Fermentor po określonym czasie hodowli opróżnia się ,ciecz pohodowlaną poddaje określonej obróbce, fermentor czyści się i proces zaczyna się od nowa.

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było poznanie ogólnych zasad prowadzenia hodowli drobnoustrojów w fermentorach oraz badania dynamiki nagromadzania produktu (np.enzymu) w podłożu hodowlanym na przykładzie proteinaz Bacillus subtilis.

3. Materiały i metody

W ćwiczeniu stosowaliśmy szczep Bacillus subtilis. Szczep przechowywany jest na podłożu stałym w temperaturze 4^oC. Materiał posiewowy do zaszczepienia inokulum stanowi biomasa bakteryjna uaktywniona w 24-godzinnej hodowli statystycznej w temperaturze 37⁰C. Inokulum otrzymuje się prze 21-24-godzinną hodowle wstrząsaną bakterii na pod…łożu N w kolbach kulistych, płaskodennych o poj. 500 ml zawierających 100 ml pożywki w temperaturze 30^oC.

Oznaczanie zmętnienia

Pomiar zmętnienia umożliwia monitorowanie wzrostu w fermentorze

Wykonanie:

Ponumerowaliśmy próbki od 1 do 7 w zależności od czasu hodowli, czyli; 1-6h hodowli; 2-12h; 3-18h; 4-24h; 5-30h; 6-36h; 7-42h, i rozcieńczyliśmy 10krotnie.

Pobieraliśmy 0,5 ml cieczy i dodaliśmy 4,5 ml wody destylowanej i zmierzyliśmy absorbancję na „spekolu” przy długości fali 660 nm; próba kontrolna jest woda.

Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczonej absorbancji obliczyliśmy zmętnienie dla poszczególnych próbek ze wzoru;

OD₆₆₀=A₆₆₀×R

Wyniki przedstawione są w tabeli poniżej

Numer próbki	Przyrost biomasy A660	Rozcieńczenie R	Zmętnienie OD660
5	0,552	x 10	5,52
6	0,664	x 10	6,64
7	0,727	x 10	7,27

Oznaczanie aktywności proteinaz metodą Ansona

Na każdą próbę robiliśmy jedna próbę badaną i jedną kontrolną

Wykonanie:

Ponumerowaliśmy próbki od 1 do 7 w zależności od czasu hodowli, czyli; 1-6h hodowli; 2-12h; 3-18h; 4-24h; 5-30h; 6-36h; 7-42h.

PROBA WŁAŚCIWA:

Do probówki wprowadzaliśmy 1 ml substratu-hemoglobiny o pH = 10,2 i 0,2 ml enzymu (są to ciecze pohodowlane, które rozcieńczyliśmy 10krotnie).

Z każdej próby pobieraliśmy 0,5 ml i dodaliśmy 0,2 ml wody destylowanej i porządnie wymieszaliśmy. Reakcja enzymatyczne trwała 10 min w temperaturze pokojowej (25^oC). Następnie po tych 10 minutach dodaliśmy do każdej próbki 2 ml kwasu trójchlorooctowego

(który powoduje denaturację enzymu i wytrąca białko z roztworu zaczął nam się wytrącać osad) i zamieszaliśmy, odstawiliśmy probówki na 30 minut (na stole). Po upływie tego czasy każda probówkę sączyliśmy i otrzymaliśmy przesącz.

PROBA KONTROLNA:

Do probówki wprowadzaliśmy 1 ml substratu-hemoglobiny i dodaliśmy 2 ml kwasu trójchlorooctowego i zamieszaliśmy. Probówki odstawiliśmy na około 3 minuty w temperaturze pokojowej (25^oC). Po upływie 3 minut dodaliśmy 0,2 ml enzymu, zamieszaliśmy i ponownie odstawiliśmy na 30 minut w temperaturze pokojowej, a nastepnie po upływie tego czasu przesączyliśmy.

Mamy 2 filtraty (przesącz) z próby właściwej i z kontrolnej.

Pobraliśmy 1 ml filtratu (z każdej próby) i dodaliśmy 2 ml 0,6 molowego NaOH, a następnie dodaliśmy 0,6 ml odczynnika Folina (1:2), zamieszaliśmy, alkalizujemy środowisko, i odstawiamy na 10 minut (na stole), a następnie po upływie czasy mierzyliśmy absorbancje na „spekolu” każdej z prób właściwych wobec odpowiadającej jej próbie kontrolnej przy długości fali 690nm.

Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczonej absorbancji obliczyliśmy aktywność proteinaz A_10,2 dla każdej z prób ze wzoru:

A_10,2=K×ΔE₆₉₀×R

gdzie:

A - jest to taka ilość enzymu która w standardowych warunkach uwalnia z tyrozyny w ciągu 1 minuty taką ilość produktów rozpuszczalnych w TCA.

R- rozcieńczenie

K- współczynnik, który pozwala na przeliczenie absorbancji na µmol_tyrozyny/(min×ml) =0,72

Przykładowe obliczenie dla próby numer 5;

E₆₉₀=0,358

R=10

K=0,72

A_10,2= 0,72× 0,358× 10

Wyniki przedstawione są w tabeli poniżej

Numer próbki	Absorbancja E690	Współczynnik K	Rozcieńczenie R	Aktywność A10,2
5	0,358	0,72	x 10	2,58
6	0,36	0,72	x 10	2,592
7	0,385	0,72	x 10	2,772

Zestawienie wyników całej grupy umieszczone w tabeli

Lp	Czas hodowli [godz]	I		II		III		IV		Średnia wyników OD660	Średnia wyników A10,2
				OD660	A10,2	OD660	A10,2	OD660	A10,2			OD660	A10,2
1	6	0,95	0	0,75	0,108	0,7	0,324	0,68	0,468	0,77	0,23
2	12	2,5	1,872	1,92	1,266	1,7	1,224	1,98	1,361	2,02	1,42
3	18	3,39	2,04	2,620	2,038	2,35	1,98	2,79	3,542	2,79	2,4
4	24	5,84	6,05	4,41	2,302	3,95	2,464	4,35	4,752	4,64	3,89
5	30	7,25	6,19	5,52	2,58	6,05	3,744	5,6	5,832	6,10	4,57
6	36	8,14	7,2	6,64	2,592	7,7	3,83	7,4	6,048	7,47	4,92
7	42	9,15	5,4	7,2	2,772	8,15	3,96	8	4,824	8,12	4,24

OD₆₆₀ - Zmętnienie

A_10,2 - Aktywność proteolityczna

Wykres zależności zmętnienia (OD₆₆₀) i aktywności proteolitycznej (A_10,2) od czasu hodowli (t)

4. Wnioski

W naszym doświadczeniu możemy zaobserwować wzrost zmętnienia. Oznaczenie zmętnienia dało nam możliwość określenia wzrostu biomasy. Zmętnienie jest pośrednim wskaźnikiem wzrostu, jest skutkiem namnażania się bakterii. W doświadczeniu tak naprawdę, mierzymy zmętnienia, ale nie wiemy konkretnie, czego, dlatego pomiar wzrostu biomasy nie jest dokładny. Duża ilość biomasy nie musi, (choć może) być równoważna dużej ilości produkowanej substancji.

Używana hemoglobina w oznaczeniu aktywności, proteinaz metodą Ansona, była już zdenaturowana mocznikiem, ponieważ taka hemoglobina jest bardziej podatna na degradacje proteolityczna. Proteinaza w wyniku reakcji odczepia produkty rozpuszczalne w kwasie trójchlorooctowym. Kwas ten denaturuje hemoglobinę i wytrąca białko, musi on całkowicie zdenaturować hemoglobinę. W próbie kontrolnej od razu do hemoglobiny dodajemy kwasu trójchlorooctowego, żeby całkowicie zdenaturować ją przed dodaniem enzymu. W przesączu zawarte są rozpuszczalne w kwasie trójchlorooctowym produkty uwolnione z hemoglobiny, a wśród nich tyrozyna i tryptofan. Do przesączu dodawaliśmy NaOH by stworzyć środowisko zasadowe. Ostateczną możliwość określenia aktywności daje nam reakcja tryptofanu i tyrozyny z odczynnikiem Folina . Z naszego doświadczenia wynika, że największy przyrost aktywności proteinazy jest w godzinach od 6 do 30, a w tych ostatnich godzinach hodowli (od 30 do 42 godziny) jest najmniejszy przyrost, najlepiej widać to na przykładzie wyników II grupy.

---