PCR - RFLP

RFLP - Restricted Fragment Length Polymorphism = polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Zastosowanie:

• wykrywanie znanych mutacji punktowych

Metoda ta wykorzystuje enzymy restrykcyjne. Umożliwia analizę sekwencji DNA poprzez analizę obecności/braku miejsc restrykcyjnych. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad.

Przebieg:

1. Wykonanie PCR.

2. Działanie restryktazy.

3. Elektroforeza + barwienie.

Interpretacja:

Zakładamy, że w badanym DNA nie ma mutacji - enzym restrykcyjny pociął DNA na 2 fragmenty. W elektroforezie będzie widać 2 prążki.

Zakładamy, że w badanym DNA jest mutacja - enzym restrykcyjny pociął DNA na 3 fragmenty. W elektroforezie będą więc 3 prążki.

Przykładem badania wykorzystującego metodę PCR-RFLP jest analiza polimorfizmu T174M - genu kodującego angiotensynogen.

CZYSTOŚĆ DNA

POMIAR ABSORBANCJI

Na początku należy rozcieńczyć preparat wodą destylowaną lub buforem TE. Kwasy nukleinowe pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal 250 - 280 nm.

Dla oceny czystości oznacza się stosunek absorbancji 260/280.

Wynik:

1,8 - 2 dobre oczyszczenie

1,5 preparat zawiera 50% białek

Absorbancja przy 260 nm = 1,000 dla:

• 1-niciowego DNA c = 22 μg/ml

• 2-niciowego DNA c = 50 μg/ml

• RNA c = 40 μg/ml

Na stężenie DNA lub RNA mogą mieć wpływ inne substancje, dlatego należy dokonać pomiaru przy innych długościach fali:

230 nm - EDTA, polisacharydy, etanol

260 nm - DNA, RNA

280 nm - białka

320 nm - drobiny komórkowe

Grupa cukrowa i fosforanowa nie wpływają na pochłanianie światła.

ELEKTROFOREZA

Jest to metoda z wyboru przy niewielkiej ilości preparatu. Po elektroforezie i wybarwieniu ocenia się jakość preparatu w transiluminatorze emitującym promieniowanie o długości fali 312 nm. Prawidłowo wyizolowany DNA w porównaniu z markerem wielkości jest widoczny w postaci zwartego prążka o wielkości ok. 50 kbp bez widocznych smug.

PCR (AMPLIFIKACJA)

PCR = Polymerase Chain Reaction = reakcja łańcuchowa polimerazy

Niezbędne komponenty:

• para starterów: 18-30 nukleotydów, z których każdy jest komplementarny do sekwencji oskrzydlających; muszą być tak zaprojektowane, aby mogły być wydłużane przez polimerazę w 2 przeciwnych kierunkach; powinny wykazywać podobną zawartość C i G

• matryca DNA (pojedyncza nić) lub RNA

• substraty (dNTP - deoksyrybonukleotydy):

• dATP - deoksy - adenozyno - tri - fosforan

• dCTP - deoksy - cytydyno - tri - fosforan

• dGTP - deoksy - guanozyno - tri - fosforan

• dTTP - deoksy - tymidyno - tri - fosforan

• polimeraza - musi być termostabilna; często używana jest polimeraza Taq z bakterii żyjących w gorących źródłach; wprowadza ona przeważnie 1 błąd na 250 nukleotydów

• bufor - do optymalizacji reakcji

• Mg²⁺ - do optymalizacji reakcji

Przebieg:

1. Denaturacja w 92-94 ^oC celem rozdzielenia nici. Powstaje matryca.

2. Przyłączenie starterów (renaturacja, aniling, hybrydyzacja) w 40-60 ^oC.

3. Elongacja (polimeryzacja) w 72 ^oC - termostabilna polimeraza syntetyzuje nową nić wykorzystując dNTP jako substraty; każda nić kopiowana jest od końca 3'

Wykonuje się ok. 20 - 40 takich cykli. Większa ilość zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia błędu.

Reakcje przeprowadza się w termocyklerach.

Zastosowanie:

• powielanie materiału genetycznego (do wielkości 2000 par zasad)

• amplifikacja wybranych fragmentów DNA lub RNA uprzednio przepisanych na cDNA

• jest to metoda alternatywna do klonowania i może być użyta do powielenia bardzo rzadkich sekwencji

Po reakcji PCR uzyskany materiał może zostać poddany:

• elektroforezie

• działaniu enzymów restrykcyjnych

• hybrydyzacji

• sekwencjonowaniu

PCR - SSCP

PCR-SSCP = Single Strand Conformation Polymorphism = polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych

Zastosowanie:

• wykrywanie nieznanych mutacji

Przebieg:

1. PCR.

2. Denaturacja termiczna - rozdzielenie nici.

3. Rozdział na żelu poliakrylamidowym natywnym.

Żel do rozdziału musi być natywny, ponieważ wędrówka cząsteczek kwasów nukleinowych w tym żelu zależy od wielkości (masy), a także od kształtu cząsteczki (konformacji), pośrednio od sekwencji nukleotydów.

Fragmenty DNA w żelu natywnym podczas elektroforezy przybierają strukturę II - i III - rzędową. Więc nawet minimalne zmiany nukleotydów (w przypadku mutacji) mogą powodować zmianę prędkości wędrówki.

PCR - HD

PCR - HD = HeteroDuplex PCR

Metoda ta polega na wykryciu powstałego na skutek mutacji braku poprawnego parowania pomiędzy nukleotydami w dwóch niciach DNA. Służy do wykrycia mutacji punktowych, ale nie da się określić, w którym miejscu zaszła mutacja.

Ograniczeniem tej metody jest długość badanego fragmentu do 200 par zasad. Po przekroczeniu tej długości skuteczność metody spada.

Przebieg:

1. PCR.

2. Denaturacja termiczna - rozdzielenie DNA na 2 nici.

3. Renaturacja - rozdzielone nici łączą się ponownie.

Interpretacja:

1. Brak mutacji.

W elektroforezie będzie jeden prążek odpowiadający homodupleksom (nić prawidłowa - nić prawidłowa).

2. Mutacja zaszła na jednej nici.

Powstają nam homodupleksy (nić prawidłowa - nić prawidłowa oraz nić nieprawidłowa - nić nieprawidłowa) i heterodupleks (nić prawidłowa - nić nieprawidłowa). W elektroforezie widzimy 2 prążki. Heterodupleksy wędrują wolniej niż homodupleksy.

3. Mutacja zaszła na 2 niciach.

Powstają nam tylko homodupleksy (nić nieprawidłowa - nić nieprawidłowa). Konieczne jest więc wprowadzenie fragmentu DNA z allelem prawidłowym. Następnie trzeba ponownie wykonać denaturację, renaturację i rozdział elektroforetyczny. Powstaną nam homodupleksy i heterodupleksy. W elektroforezie będą 2 prążki.

TECHNIKI PRZESIEWOWE DO WYKRYWANIA ZMIAN NUKLEOTYDÓW

Techniki te wykorzystują produkty PCR i pozwalają na wykrycie i identyfikację mutacji. Są oparte na porównaniu wielkości i właściwości badanych fragmentów DNA.

DNA ulega najpierw amplifikacji, a następnie jest rozdzielany na żelu poliakrylamidowym natywnym lub denaturującym. Metody te pozwalają na wykazanie, czy w danej cząsteczce DNA nastąpiła zmiana sekwencji nukleotydów. Zaliczamy do nich:

• PCR-HD

• PCR-SSCP

• PCR-DGGE/TGGE

PCR DGGE/TGGE

Jest to analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika denaturującego. Powielone w PCR fragmenty DNA nanosi się na żel poliakrylamidowy, na którym utworzony jest rosnący gradient czynnika denaturującego:

• mocznik 2 - 40%

• formaldehyd 2 - 7 M

• chlorowodorek guanidyny

• temperatura.

Fragment DNA, migrując w żelu, natrafia na takie stężenie czynnika, które powoduje dysocjację podwójnej helisy na pojedyncze nici. W rezultacie w obrazie elektroforetycznym otrzymuje się różne prążki świadczące o zaburzeniach struktury DNA. Metoda ta umożliwia wykrycie nieznanych mutacji.

ŻEL DENATURUJĄCY

Służy do dokładnego określenia wielkości cząsteczek poprzez wyeliminowanie różnic migracji wywołanych różną konformacją. Jest to ważne w przypadku 1-niciowego RNA, który miejscami może tworzyć struktury 2-niciowe.

Czynniki denaturujące zapobiegają tworzeniu się par przez zasady azotowe.

Przeciwieństwem jest żel natywny, w którym nie dochodzi do denaturacji, a rozdział odbywa się także według konformacji cząsteczki. Po takiej elektroforezie enzymy zachowują swoją aktywność.

IZOLOWANIE DNA Z KRWI PEŁNEJ

Przebieg:

1. Pobranie krwi (1ml na wersenian disodowy).

2. Liza komórek bezjądrowych.

3. Odwirowanie leukocytów uzyskanie osadu jąder.

4. Liza otrzymanego osadu jąder buforem do lizy.

5. Odbiałczanie poprzez:

• ekstrakcję DNA chloroformem lub fenolem

• wytrącenie białka NaCl / LiCl

6. Wytrącenie DNA etanolem lub izopropanolem.

7. Przemycie osadu 70 % etanolem.

8. Wysuszenie.

9. Rozpuszczenie w buforze.

SOUTHERN BLOT

Przebieg:

1. Replikacja całego genomu

2. Cięcie otrzymanego materiału przez restryktazy.

3. Rozdział w elektroforezie.

Zastosowanie:

• identyfikacja ludzi

• określanie stopnia pokrewieństwa

IZOLOWANIE RNA

RNA jest mniej stabilny termodynamicznie niż DNA, ponieważ posiada grupę hydroksylową w pozycji 2'rybozy.

Ważne jest, by szybko zahamować rybonukleazy (wyjątkowo stabilne i aktywne enzymy, szybko degradują RNA). Do tego może posłużyć dietylopirowęglan (DEPC). Powinny go zawierać wszystkie odczynniki. Należy pamiętać, że jest silnie mutagenny.

Przebieg:

1. Liza i homogenizacja próbki w buforze denaturującym zwierającym GITC (izotiocyjanian guanidyny), który hamuje też rybonukleazy.

2. Lizat pełny lub rozfrakcjonowany (po dodaniu etanolu) nanoszony jest na mini-kolumnę.

3. Następuje selektywna i specyficzna absorpcja RNA do filtru krzemionkowego.

4. Kolumnę przemywa się w celu usunięcia zanieczyszczeń.

5. RNA eluuje się czystą wodą.

Z 30 mg tkanki (lub 1 x 10^-7 komórek) można uzyskać 200 μg RNA o długości powyżej 200 nukleotydów. Przechowywać można ten materiał przez rok w temperaturze -20 do -70 ⁰C.

IZOLOWANIE DNA Z PLEMNIKÓW

Jest to metoda preferencyjnej lizy.

Chromatyna plemników odporna jest na Lizę z udziałem SDS (siarczanu dodecylu sodu) i proteinazy K w przeciwieństwie do chromatyny somatycznej. Jest to spowodowane tym, że zamiast histonów w plemnikach występują protaminy.

Reszty cysteinowe tworzą dużą liczbę wiązań dwusirczkowych tworzą dużą liczbę wiązań dwusiarczkowych w plemnikach. Nie działają tu detergenty i egzogenne proteinazy, tylko ditiotreitol, który te wiązania redukuje.

BARWIENIE DNA

BROMEK ETYDYNY

• łatwo interkaluje w cząsteczkę kwasu nukleinowego

• maksimum fluorescencji przy długości fali 302 - 312 nm; jest 10 x większa niż samgo bromku

• dodaje się go bezpośrednio do żelu lub wybarwia się żel barwnikiem po elektroforezie

• wykrywa kilka ng DNA

• znacznie lepiej wbudowuje się w DNA dwuniciowy

AZOTAN SREBRA

• znacznie czulszy od bromku etydyny - wykrywa 1-10 pg DNA / 1 mm²

• jest to technika fotochemiczna

• etapy:

1. dodanie azotanu srebra (srebro + DNA = nierozpuszczalna sól)

2. dokładne odpłukanie srebra niezwiązanego

3. redukcja srebra Na₂CO₃ i formaldehydem (lub tiosiarczanem sodu) - zredukowane srebro jest brązowe (widać prążki)

• „srebrzenie” jest lepsze dla żelów poliakrylamidowych

• z wybarwionego żelu DNA można ekstrahować do dalszych analiz

• wada metody: duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne

ELEKTROFOREZA

DNA i RNA mają ładunek (-), więc wędrują do (+), czyli do anody.

Ruchliwość elektroforetyczna zależy od:

• masy cząsteczkowej DNA (jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego liczby par zasad)

• struktury (konformacji) - kolista wędruje najszybciej

• stężenia agarowy / poliakrylamidu (wzrost stężenia spowalnia wędrówkę)

• natężenia pola elektrycznego (najczęściej jest 5 V / cm)

• temperatury

• składu buforu

• siły jonowej buforu

ŻEL AGAROZOWY

Zdolność rozdzielcza zależy do wielkości oczek (porów) sita w żelu. Te rozmiary można zmieniać przez zmianę stężenia agarozy.

1,4 - 2% 0,3 - 2 kb

0,8% 2 - 10 kb

0,5 - 0,7% 10 - 20 kb

Żel agarozowy pozwala na rozdział cząsteczek tej samej wielkości, ale innego kształtu.

ŻEL POLIAKRYLAMIDOWY

Otrzymuje się go poprzez polimeryzację akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez dodanie bis-akrylamidu.

Stężenie można regulować poprzez zmianę stosunku stężenia akrylamidu do bis-akrylamidu.

Do polimeryzacji potrzebny jest katalizator - nadsiarczan amonowy lub potasowy - i związek inicjujący rekację - TEMED (N,N,N',N'- tetra-metylo-etyleno-di-amina).

20% - do 200 pz

3% - do 1000 pz

POLIMORFIZM INSERCYJNO-DELECYJNY

GENU ENZYMU KONWERTUJĄCEGO

Polimorfizmy genów kodujących elementy układu renina-angiotensyna mogą być czynnikami predysponującymi do wystąpienia chorób układu krążenia. Może dojść do nadmiernej aktywacji tkankowego układu RA. Ma to udział w patogenezie miażdżycy, zawału.

Polimorfizm genu kodującego enzym konwertujący polega na:

• występowaniu ( I - insercja)

lub

• braku (D - delecja)

fragmentu 287 pz w obrębie intronu 16.

U nosicieli allelu D jest wzrost aktywności enzymu konwertującego i wzrost stężenia tego białka w surowicy krwi.

Analiza tego polimorfizmu obejmuje:

1. Izolowanie.

2. PCR.

3. Elektroforeza.

Po rozdziale na żelu agarozowym mogą być takie warianty:

• jeden prążek odpowiadający genotypowi II - 2 x insercja, więc fragment jest najcięższy, wolno wędruje, jest blisko startu próby

• dwa prążki odpowiadające genotypowi ID - jeden fragment z insercją jest cięższy i jeden fragment z delecją jest lżejszy

• jeden prążek odpowiadający genotypowi DD - 2 x delecja, więc oba fragmenty są lekkie i wędrują nadalej

POLIMORFIZM T174M

Polimorfizm ten polega na zmianie zasad (T C) w kodonie 174 genu kodującego angiotensynogen.

Restryktaza NcoI hydrolizuje nić DNA w miejscu występowania sekwencji

5' -C I C - A - T - G - G - 3'

3' - G - G - T - A - C I C - 5'

allel T - po trawieniu produktu PCR powstaje fragment 303 pz

allel M - pojawia się miejsce restrykcyjne; powstają 2 fragmenty (210 i 93 pz); mają lepkie końce, przed elektroforezą trzeba je rozłączyć

Po rozdziale na żelu poliakrylamidowym mogą być takie warianty:

• jeden fragment najbliżej startu - ciężki, odpowiada genotypowi TT

• dwa fragmenty - odpowiadajć genotypowi MM

• trzy fragmenty - odpowiadają genotypowi TM (bo na jednej nici nie ma cięcia, a druga dzieli się na 2 części)

STR

STR = Short Tandem Repeats = polimorfizm długości krótkich fragmentów powtórzonych

W ludzkim genomie znajdują się fragmenty DNA zbudowane z licznych powtarzających się sekwencji kilku nukleotydów. Ilość takich powtórzeń jest zmienna i unikalna dla każdej osoby.

Przebieg:

1. Zaprojektowanie odpowiednich sond molekularnych komplementarnych do poszukiwanego fragmentu.

2. Hybrydyzacja sondy z odpowiednim fragmentem.

3. Użycie ligazy, aby połączyć sondy ze sobą (te, które są obok siebie).

4. Denaturacja - oddzielenie nici DNA od połączonych sond.

5. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym - położenie prążka świadczy o jego masie.

SEKWENCJONOWANIE DNA

METODA SANGERA

Jest oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksymnukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie nie pozwala na dalsze wydłużanie nici. Tym sposobem powstają fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem.

Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduje ich segregację względem wielkości.

Przeprowadza się 4 oddzielne reakcje różniące się specyficznym terminującym dideoksynukleotydem (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).

METODA MAXAMA I GILBERTA

Jest to metoda chemiczna polegająca na cięciu DNA w specyficznych miejscach przez różne substancje, np.:

• kwas mrówkowy (A,G)

• hydrazynę (C,T)

• hydrazynę w dużym stężeniu soli (T)

Otrzymujemy w ten sposób 4 ścieżki, dzięki którym możemy określi sekwencję DNA.

LCR

LCR = Ligase Chain Reaction = ligazowa reakcja łąńcuchowa

Konieczna jest znajomość sekwencji badanego fragmentu DNA, aby stworzyć komplementarne markery, które będą działać na zasadzie starterów - przyłączą się do DNA. Nie ma tu jednak etapu ich wydłużania. Nie wykorzystywana jest polimeraza.

W reakcji LCR stosuje się termostabilną ligazę, która łączy markery. Są one znacznie dłuższe niż w PCR. Dobierane są tak, aby nie było między nimi żadnej luki i mogły przylegać do siebie i dzięki temu mogła je połączyć ligaza. Następnie należy zdenaturować próbkę celem rozsunięcia nici.

Zastosowanie:

• wykrywanie mutacji punktowych

Odmiany:

• P/LCR - reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy

• GAP-LCR - reakcja łańcuchowa ligazy z „przerwą”

WYKRYWANIE ZNANYCH MUTACJI

RG-PCR / ACRS-PCR = Restriction-site Generating PCR / Amplification Created Restriction Site PCR

Polega na wprowadzeniu takiej zmiany nukleotydów do powielanego materiału, aby łącznie ze zmianą powstałą w wyniku mutacji utworzyło się miejsce charakterystyczne dla danego enzymu restrykcyjnego. Wprowadzanie zmian zachodzi za pomocą odpowiednio stworzonych starterów.

ARMS-PCR / ASA-PCR = Amplification Refraktory Mutation PCR / Allele Specific Amplification

Sposobem tym można odróżnić badane allele (czy jest to forma prawidłowa, czy mutacja homo- lub heterozygotyczna). Stosuje się 2 startery - jeden jest komplementarny do sekwencji prawidłowej, a drugi do zmutowanej.

PCR-ASO = Allele Specific Oligonucleotide Hybridisation

Amplifikuje się wszystkie allele. Następnie dodaje się 2 sondy molekularne, skonstruowane na zasadzie komplementarności (jedna do sekwencji prawidłowej, druga do sekwencji zmutowanej). Jeśli sondy natrafią na fragment komplementarny do siebie, hybrydyzują. Sondy są znakowane znacznikiem fluorescencyjnym.

RT-PCR

RT-PCR = Reverse Transcription PCR

• technika połączona z odwrotną transkrypcją

• pozwala na analizę ekspresji genów

• matrycą jest RNA

Zastosowanie:

• pozwala na wykrywanie patogenów (których materiałem genetycznym jest RNA, np. wirus HIV)

Informacje z RNA zostają przepisane na DNA. Dzieje się to dzięki odwrotnej transkryptazie. Na matrycy RNA powstaje więc jednoniciowy cDNA. Następnie amplifikuje się go w reakcji PCR.

ODWRÓCONY PCR

Zastosowanie:

• powielenie fragmentów fragmentów nieznanej sekwencji

Uwagi:

• niezbędna jest znajomość sekwencji wewnętrznej otoczonej przez nieznaną sekwencję

Przebieg:

1. Cięcie nici za pomocą enzymu restrykcyjnego - powstaje m.in. fragment, który chcemy powielić.

2. Połączenie się końców badanego fragmentu.

3. Cięcie tego okręgu za pomocą enzymu restrykcyjnego - powstaje liniowy fragment DNA, który na końcach ma znaną nam sekwencję.

4. Reakcja z zaprojektowanymi starterami komplementarnymi do znanej sekwencji.

5. PCR.

WEWNĘTRZNY PCR

Wykorzystuje się 2 pary starterów. Jedna para jest umieszczona wewnętrznie w stosunku do drugiej. Amplifikacja przeprowadzona z pierwszą parą starterów pozwala na uzyskanie dużych fragmentów (1000 - 2000 pz).

Następnie przeprowadza się amplifikację z drugą parą starterów, uzyskując mniejsze fragmenty. Podwyższa to specyficzność procesu - startery wewnętrzne „sprawdzają”, czy zewnętrzne powieliły wybrany fragment. Polega to na tym, że jeśli powstał błąd, to startery wewnętrzne nie rozpoczną amplifikacji, ponieważ nie rozpoznają specyficznych i komplementarnych dla siebie par zasad.

TEST SCHILINGA

Cel:

• ocena stopnia wchłaniania witaminy B₁₂ z przewodu pokarmowego na podstawie radioaktywności moczu

• pozwala na określenie możliwej przyczyny braku witaminy B₁₂

Wykonanie:

1. CZĘŚĆ

Pacjentowi podaje się doustnie dawkę (0,001 mg) znakowanej izotopowo witaminy B₁₂. Po w godzinach domięśniowo wstrzykuje się 1 mg witaminy B₁₂ nie znakowanej (po to, aby wyprzeć ewentualnie wchłoniętą część).

2. CZĘŚĆ

Wykonywana jest po upływie 5 dni. Pacjentowi podaje się znakowaną witaminę B₁₂ wraz z 60 mg świńskiego IF (czynnik wewnętrzny Castle`a).

Interpretacja:

• prawidłowe wchłanianie: po części I ilość radioaktywnej witaminy B₁₂ w moczu (DZM) > 16% dawki przyjętej doustnie

• upośledzone wchłanianie: radioaktywność moczu niższa

• normalizacja wyniku w II części: powodem złego wchłaniania jest brak IF

• brak normalizacji w II części: polekowe złe wchłanianie witaminy B₁₂, niewydolność trzustki, zespół Zollingera-Ellisona, nieprawidłowa flora bakteryjne

Ograniczenia:

• choroby nerek (fałszywie niskie wyniki)

TEST KSANTURENOWY

Cel:

• ocena poziomu witaminy B₆ w organizmie

Zasada metody:

Witamina B₆ uczestniczy w katabolizmie tryptofanu. Fosforan pirydoksalu pełni tu funkcję koenzymu kinureninazy.

W stanach niedoboru dochodzi do zaburzeń przemian metabolicznych, w wyniku których powstaje kwas ksanturenowy wydalany z moczem.

Wykonanie:

1. Podanie pacjentowi 10 g tryptofanu w 250 cm³ wody.

2. Przeprowadzenie DZM.

Interpretacja:

• bez obciążania tryptofanem, w prawidłowym stężeniu witaminy B₆ kwas ksanturenowy nie powstaje lub jego stężenie mieści się w granicach normy

• po obciążeniu, w prawidłowym stężeniu B₆ wydalanie kwasu ksanturenowego może wynosić 20 mg/dobę

• po obciążeniu, w niedoborze witaminy B₆ wydalanie > 50 mg/dobę

Ograniczenia:

• test ten jest mało swoisty i wydalanie 20 mg/dobę nie stanowi pewnego dowodu na prawidłowe stężenie witaminy B₆ w organizmie (jest tak dlatego, ponieważ tryptofan jest zawarty w różnych związkach w organizmie)

WITAMINA B₁₂

Budowa:

Związek pierścieniowy (tetrapirolowy; pseudoporfirynowy = korynowy) z centralnie usytuowanym atomem kobaltu (może tworzyć 6 wiązań koordynacyjnych z ligandami).

Formy aktywne:

• hydroksykobalamina (-OH)

• metylokobalamina (-CH₃)

• dezoksyadenozylokobalamina (-AdO)

• cyjanokobalamina (-CN) - syntetyczna witamina, najbardziej stabilna, ma postać krystaliczną (ciemnoczerwone igły), stosuje się ją w leczeniu

Źródła:

• mięso (tylko!)

• bakterie jelita grubego - nie ma to znaczenia, ponieważ wchłanianie odbywa się w jelicie krętym

Zapotrzebowanie:

• 0,015 mg/dobę

Funkcje:

Składnik koenzymów kobamidowych uczestniczących w reakcjach:

• konwersja metylomalonylo-CoA do bursztynylo-CoA

• udział w przemianach rozgałęzionych aminokwasów i kwasów tłuszczowych o nieparzystej ilości atomów węgla

• brak B₁₂ powoduje gromadzenie się metylomalonylo-CoA i propionylo-CoA

• metylacja homocysteiny do metioniny

• brak B₁₂ powoduje niemożność przejścia metylotetrahydrofolianu do tetrahydrofolianu (istota „pułapki folianowej”)

Metabolizm:

1. Połączenie B₁₂ z IF w żołądku

2. Wchłanianie w dystalnym odcinku jelita cienkiego i jelicie krętym.

3. Transport w osoczu (za pomocą transkobalamin - inne są w żyle wrotnej, inne transportują z wątroby na obwód).

4. Magazynowanie w wątrobie - zapas wystarcza na 2-3 lata.

Przyczyny niedoboru:

• niedostateczna podaż (wegetarianie)

• wrodzony brak czynnika wewnętrznego (lub uwarunkowany immunologicznie)

• resekcja żołądka

• upośledzone wydzielanie IF

• zaburzenie wchłaniania kompleksu B₁₂-IF

• resekcja dystalnego odcinka jelita krętego

• upośledzone wiązanie B₁₂ przez białka osocza z jej utratą w nerkach (defekt transkoblaminy I lub II)

Skutki niedoboru:

• układ krwionośny

• niedokrwistość makrocytowa (megaloblastoza w szpiku kostnym)

• hipersegmentacja granulocytów

• przewód pokarmowy

• zanik nabłonka wydzielniczego żołądka i jelit

• zapalenie języka

• układ nerwowy

• zaburzenia psychiczne

• zmiany zwyrodnieniowe sznurów tylnobocznych rdzenia kręgowego

• acyduria metylomalonowa

• hiperhomocysteinemia

Uwagi:

• witaminy B₁₂ nie należy podawać chorym na nowotwory

MMA

MMA - kwas metylomalonowy

Cel:

• różnicowanie niedokrwistości megaloblastycznych:

• wzrost wydalania MMA w niedoborze B₁₂

• takie samo wydalanie MMA nawet po obciążeniu sugeruje brak witaminy B₁₁

Zasada metody:

Wykonanie:

1. Pacjentowi podaje się walinę lub metioninę.

2. DZM.

3. Oznaczenie stężenia MMA metodą kolorymetryczną.

Interpretacja:

• bez obciążenia, prawidłowe wydalanie MMA = 0 - 11 mg/dobę

• bez obciążenia, w niedoborze B₁₂ MMA = 37 - 750 mg/dobę

• po obciążeniu, w niedoborze B₁₂ MMA > 1000 mg/dobę

Ograniczenia:

• niewyrównana choroba Addisona-Biermera (wzrost wydalania MMA dopiero po obciążeniu)

• remisja choroby Addisona-Biermera, marskość wątroby, obniżone wydzielanie IF (brak wzrostu wydalania MMA nawet po obciążeniu)

KLIRENS KWASU FOLIOWEGO

Cel:

• ocena, czy stężenie kwasu foliowego jest w normie

Klirens jest proporcjonalny do zasobów ustrojowych. Niedobór powoduje przyspieszone znikanie z osocza po doustnym obciążeniu.

Wykonanie:

1. Dożylne podanie kwasu foliowego w dawce 15 μg/kg masy ciała

2. Oznaczenie stężenia w surowicy w odpowiednich odstępach czasowych.

Interpretacja:

• prawidłowe stężenie, gdy:

po 3 minutach - 127 μg/l

po 15 minutach - 40 μg/l

po 30 minutach - 20 μg/l

W uproszczonej wersji testu stężenie kwasu foliowego oznacza się jednorazowo po 15 minutach od obciążenia. Prawidłowo wynik powinien wynosić 21-80 μg/l.

Szybkość oczyszczania osocza z kwasu foliowego zależy od aktywności reduktazy kwasu foliowego.

TEST FIGLU

Cel:

• ocena stężenia kwasu foliowego w surowicy krwi

Zasada metody:

Wykonanie:

1. Pacjentowi podaje się na czczo 10-15 g histydyny rozpuszczonej w wodzie.

2. Przeprowadza się zbiórkę moczu pomiędzy 3 a 8 godziną od podania histydyny.

3. W pobranej próbce oznacza się stężenie kwasu formiminoglutaminowego metodą:

• elektroforetyczną - bada się intensywność prążka elektroforegramu ze wzorcem

• spektrofotometryczną - porównuje się zabarwienie moczu względem moczu wzorcowego.

Interpretacja:

• wynik podaje się jako FIGLU dodatni (+) lub FIGLU ujemny (-)

• osoby zdrowe wydalają FIGLU nie więcej niż 2 mg/godzinę

• osoby z niedoborem kwasu foliowego wydalają FIGLU w ilości do 80 mg/godzinę

Wzrost wydalania FIGLU występuje też w:

• chorobach miąższu wątroby

• większości przypadków niedoboru witaminy B₁₂

TEST OPTYCZNY PROSTY (WARBURGA)

Służy do oznaczania aktywności dehydrogenaz zależnych od NAD⁺ (NADP⁺).

Przykład:

LDH

mleczan + NAD⁺ pirogronian + NADH + H⁺

Redukcja NAD⁺ monitorowana jest poprzez pomiar przyrostu absorbancji przy długości fali 340 nm, który jest proporcjonalny do aktywności enzymu.

TEST OPTYCZNY Z REAKCJĄ WSKAŹNIKOWĄ

Może służyć do oznaczania aktywności AlAT i AspAT. Test ten obejmuje dodatkowe reakcje wskaźnikowe katalizowane odpowiednio przez: dehydrogenazę mleczanową (LDH) i dehydrogenazę jabłczanową (MDH).

AlAT

L-alanina + α-ketoglutaran pirogronian + glutaminian

LDH

pirogronian + NADH + H⁺ mleczan + NAD⁺

AspAT

L-asparaginian + α-ketoglutaran szczwiooctan + glutaminian

MDH

szczawiooctan + NADH + H⁺ jabłczan + NAD⁺

Szybkość obniżania absorbancji przy długości fali 340 nm spowodowana utlenianiem NADH w reakcji wskaźnikowej jest proporcjonalna do aktywności odpowiednio AlAT lub AspAT.

TEST OPTYCZNY Z REAKCJĄ POMOCNICZĄ I WSKAŹNIKOWĄ

Może służyć do oznaczania aktywności kinezy kreatynowej (CK).

CK

fosfokreatyna + ADP kreatyna + ATP

heksokinaza

ATP + glukoza ADP + glukozo-6-fosforan

dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

glukozo-6-fosforan + NADP⁺ 6-fosfoglukonian + NADPH + H⁺

Reakcja pomocnicza: reakcja z heksokinazą.

Reakcja wskaźnikowa: reakcja z dehydrogenazą glukozo-6-fosforanową.

Przyrost absorbancji przy długości fali 340 nm spowodowany powstawaniem NADPH + H⁺ jest wprost proporcjonalny do aktywności kinezy kreatynowej.

TIBC

TIBC = Total Iron Binding Capacity = całkowita zdolność wiązania żelaza przez surowicę

Cel:

• różnicowanie przyczyn niedoboru żelaza

Zasada:

Prawidłowo transferyna jest wysycona żelazem w 30%. Po dodaniu żelaza do próbki możemy wysycać pozostałe 70%.

Wykonanie:

1. Pobranie krwi.

2. Do surowicy dodajemy Fe³⁺.

3. Nadmiar wolnych Fe³⁺ usuwa się stosując węglan magnezu.

4. Redukcja pozostałych Fe³⁺

5. Sól disodowa kwasu batofenantrolino-disulfonowego tworzy z Fe²⁺ w środowisku wodnym stabilny kompleks o barwie czerwonej.

6. Pomiar absorbancji.

Oprócz wykonania TIBC należy pamiętać o oznaczeniu stężenia żelaza w surowicy krwi.

Fe osocza	TIBC
		niedobór żelaza
	=	choroby ostre
		przewlekłe infekcje
		nowotwory
		hemochromatoza
/=		marskość wątroby
		antykoncepcja hormonalna doustna

Normy:

45 - 70 μmol/l

250 - 400 μg/dl

DIAGNOSTYKA GOSPODARKI ŻELAZOWEJ

1. Stężenie żelaza w surowicy

Oznacza się stosując disulfonian batofenantroliny.

Nie do oznaczania razem z EDTA.

Stężenie żelaza w surowicy odzwierciedla tylko jego niewielką pulę i zależy od wielu czynników (wykazuje np. rytm dobowy i miesięczny).

Norma: 80 - 120 μg% 13 - 32 μmol/l

2. Stężenie transferyny

Oznacza się metodami immunochemicznymi.

Oznaczenie ma wartość diagnostyczną tylko w połączeniu z badaniem Fe w surowicy i wysycenia transferyny.

Wzrost obserwuje się w:

• ciąży

• podawaniu estrogenów

• niskim stężeniu Fe w niepowikłanym niedoborze

Spadek obserwuje się w:

• niedokrwistości nie związanej z niedoborem Fe

• stanach zapalnych

• nowotworach

• przewlekłych uszkodzeniach wątroby

• niedożywieniu

• zespole nerczycowym

Norma: 1,2 - 2,5 g/l

3. Stężenie receptora transferyny

Oznaczane metodami ELISA - używa się przeciwciała monoklonalnego przeciwko rozpuszczalnemu receptorowi.

Wzrost:

• we wczesnym etapie niedoboru Fe

• we wzmożonej erytropoezie

Stężenie nie zmienia się w niedokrwistościach towarzyszących chorobom przewlekłym.

4. Stężenie ferrytyny.

Pozwala na wykrycie zmniejszonych zapasów Fe zanim wystąpi niedokrwistość mikrocytarna.

Norma: 15 - 200 μg/l

5. Test doustnego obciążenia żelazem (krzywa żelazowa).

Służy do oceny wchłaniania z przewodu pokarmowego.

Wykonanie:

1. Doustnie podaje się 1 g siarczanu (VI) żelaza (III).

2. Oznacza się stężenie co 1h przez 6h (maximum powinno być po 3h).

Interpretacja:

• prawidłowo, przyrost stężenia żelaza nie przekracza 100% wartości wyjściowej

• w niedoborach, przy prawidłowym wchłanianiu, przyrost stężenia jest gwałtowny

• nieprawidłowe wchłanianie: krzywa płaska

6. Test desferoksaminowy

Do oceny przeładowania organizmu żelazem.

Desferoksamina tworzy kompleksy z żelazem, co powoduje zwiększone wydalanie żelaza z moczem.

Test ten jest jednocześnie leczniczy.

Stosuje się do niego Desferal.

Interpretacja:

• po podaniu osoby zdrowe wydalają mniej niż 1 mg

• w niedokrwistości z niedoboru Fe wydalanie jest mniejsze niż 1 mg

• w hemochromatozie, hemosyderozie - wydalanie jest wybitnie zwiększone

7. TIBC

ŻELAZO

Ilość:

• w organizmie: 3 - 5 g

• w surowicy: 13 - 32 μmol/l 70 - 180 μg/dl

• 57,5% hemoglobina

• 9% mioglobina

• 33% żelazo niehemowe

• 0,1% związane z transferyną

• 0,25% związane z enzymami

Zapotrzebowanie:

• mężczyźni 1,5 mg

• kobiety 2 mg

• kobiety w ciąży 3 mg

• kobiety karmiące 3,5 mg

• dzieci i młodzież 2,5 mg

Źródła:

• wątroba

• nerki

• serce

• orzechy

• daktyle

• szpinak

• fasola szparagowa

Metabolizm:

1. Wchłanianie (w 10%) w dwunastnicy i górnym odcinku jelita cienkiego w postaci jonów dwuwartościowych.

2. W komórkach nabłonka jelitowego transport przy udziale DMT (transporter jonów dwuwartościowych) i wbudowywanie do apoferrytyny (powstaje ferrytyna).

3. Uwolnienie do krążenia.

4. Transport w osoczu w połączeniu z transferyną.

5. Wydalanie z kałem, moczem, potem, śliną, żółcią, krwią miesięczną.

Przyczyny niedoboru:

• utrata krwi

• upośledzone wchłanianie

• resekcja żołądka

• bezkwaśność

• choroby jelit

• choroby trzustki

• cholestaza

• zwiększone zapotrzebowanie

• niedobór w pożywieniu

• zaburzenie metabolizmu

• atransferynemia

• hipotransferynemia

Skutki niedoboru:

• niedokrwistość mikrocytarna

Przyczyny nadmiaru:

• upośledzona erytropoeza (niedokrwistość aplastyczna)

• nadmierny rozpad erytrocytów (niedokrwistość hemolityczna)

• nadmierne uwalnianie z uszkodzonych komórek wątroby (np. w WZW)

• nadmierne wchłanianie

• podawanie pozajelitowe

Skutki nadmiaru:

• hemosyderoza

• hemochromatoza

• udział w reakcjach wolnorodnikowych

JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

MIĘDZYNARODOWA JEDNOSTKA STANDARDOWA ENZYMU (U / IU)

Jest to taka aktywność enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmol substratu lub grup chemicznych w ciągu 60 sekund w temperaturze 30 ⁰C w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu.

1 U = 16,67 x 10^-9 kat ~ 17 nkat

KATAL

Jest to taka aktywność enzymu, która przekształca 1 mol substratu w czasie 1 sekundy w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu.

1 kat = 6 x 10⁷ U

AKTYWNOŚĆ WŁAŚCIWA

Określa stopień czystości preparatów. Wyrażana jest w U/mg białka lub μkat/kg.

AKTYWNOŚĆ MOLEKULARNA

Określa reaktywność enzymu: liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty w czasie 60 sekund przez 1 cząsteczkę enzymu.

AKTYWNOŚĆ CENTRUM KATALITYCZNEGO

Jest to aktywność molekularna podzielona przez liczbę centrów aktywnych w enzymie.

AKTYWNOŚĆ MOLARNA

Wyraża się w katalach na mol enzymu.

STĘŻENIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ W ROZTWORZE

Przeliczenie stężenia aktywności enzymatycznej na 1 litr przy oznaczeniu aktywności enzymu w płynach biologicznych.

JEDNOSTKA BODANSKY`EGO

Służy do oznaczania aktywności fosfataz.

Ilość uwolnionego fosforu z β-glicerofosforanu sodu przez fosfatazę znajdującą się w 100 ml surowicy w ciągu 1h w temperaturze 37 ⁰C w pH 8,6 (dla fosfatazy zasadowej) lub pH 5 (dla fosfatazy kwaśnej).

1 JB = 5,35 U

JEDNOSTKA KINGA-ARMSTRONGA

Służy do oznaczania aktywności fosfataz.

Ilość mg uwolnionego fenolu z fenylofosforanu dwusodowego przez fosfatazę znajdującą się w 100 ml surowicy w 37 ⁰C w ciągu 15 minut w pH 8,6 (fosfataza zasadowa) lub w ciągu 60 minut w pH 4,9 (fosfataza kwaśna).

1 JK-A = 7,09 U (fosfataza zasadowa)

1 JK-A = 1,77 U (fosfataza kwaśna)

JEDNOSTKA CARAWAY`A

Służy do oznaczania aktywności amylazy.

Jest to taka aktywność enzymu, która hydrolizuje 10 mg skrobii w ciągu 30 minut do stopnia, w którym zanika reakcja barwna z jodem.

Wyraża się ją w odniesieniu do 100 ml materiału badanego.

Absorbancja próby badanej nie może być mniejsza (mierzy się ubytek substratu) niż 50% absorbancji próby kontrolnej. W przeciwnym wypadku materiał badany należy rozcieńczyć.

BADANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

METODY DWUPUNKTOWE

Czas zero to zmieszanie enzymu z substratem, po określonym czasie przerywa się reakcję i oznacza stężenie substratu lub produktu.

Warunki reakcji są tak dobrane, aby prędkość reakcji była stała. Tylko szybkość początkowa jest proporcjonalna do ilości enzymu.

METODY KINETYCZNE

Oparte są na stałym pomiarze (np. co 15 sekund) ubytku substratu lub przyrostu produktu.

Najczęściej wykorzystuje się właściwości optyczne dinukleotydów nikotynamidoadeninowych (NAD i NADP). W postaci utlenionej maksimum absorbancji wykazują przy fali długości 260 nm, a w postaci zredukowanej przy 340 nm.

Można też wykorzystać inne reakcje do pomiaru np. związków, które powstały przy okazji. Np. w reakcji katalizowanej przez GGTP z γ-glutamylo-4-nitroanilidu powstaje 4-nitroanilina, która jest żółta.

IZOLOWANIE BIAŁEK Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

OSMOLIZA

Jest to łagodna metoda wykorzystywana do rozbijania komórek, w czasie której komórki poddaje się działaniu roztworów hipoosmotycznych, a następnie łagodnie powoli zasysa się do pipety.

Można również stosować enzymy - trypsynę, kolagenazę, lizozym, w stężeniach od 0.1 do 1%, które niszczą ścianę komórkową lub macierz zewnątrzkomórkową i następnie poddać działaniu roztworów hipoosmotycznych.

HOMOGENIZACJA

Polega na krojeniu tkanek na małe fragmenty. Proces ten wymaga stosowania chłodzenia w łaźni lodowej, co zapobiega przegrzewaniu się homogenatów.

SONIFIKACJA

Polega na wykorzystaniu ultradźwięków wytwarzanych przez generator elektryczny, które uszkadzają komórki. Wymagane jest również chłodzenie lodem tkanek i dalsze ich rozdrabnianie w homogenizatorach, które niszczą błony komórkowe.

METODA KIEJDAHLA

• pozwala na ilościowe oznaczenie azotu w próbce

• badany materiał należy najpierw oczyścić z niebiałkowych związków azotowych

• jest to metoda referencyjna do standaryzacji innych metod

Przebieg:

białko + H₂SO₄ (NH)₄SO₄

(NH)₄SO₄ + 2 NaOH Na₂SO₄ + NH₃ + H₂O

2 NH₃ + H₂SO₄ (NH)₄SO₄

H₂SO₄ + 2 NaOH Na₂SO₄ + 2 H₂O

Czyste białka zawierają stałą ilość azotu, zwykle ok. 15-16% swojej masy. Oznaczoną ilość azotu mnoży się przez odpowiedni współczynnik - 6,25 dla białek surowicy.

Zawartość azotu w poszczególnych białkach jest różna i zależy od zawartości aminokwasów kwaśnych i zasadowych w białku => protaminy zawierają 30% białka, a mucyny - 12%.

METODY KOLORYMETRYCZNE

BIURETOWA

Zasada:

jony miedziowe tworzą z wiązaniami peptydowymi w środowisku zasadowym kompleks o zabarwieniu fiołkowym

Reakcję tą dają:

• białka

• amidy α-aminokwasów

• dwumocznik (biuret)

Metody tej nie należy stosować w obecności soli amonowych i siarczanu magnezu, ponieważ sole te zaburzają ilościowe wiązanie jonów miedziowych.

LOWRY`EGO

• jest znacznie czulsza - wykrywa stężenie 10 - 100 μg/ml

Wykonanie:

1. Reakcja biuretowa.

2. Redukcja odczynnika fosfomolibdeno-fosfowolframowego (Folina-Ciocalteau) do błękitu molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan.

W zależności od składu aminokwasowego (zawartości tyrozyny i tryptofanu) poszczególne białka dają różne natężenia barwy. Należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe.

Z odczynnikiem Folina-Ciocalteau reagują też inne substancje:

• wzrost natężenia barwy powodują:

• fenole i pochodne

• puryny, pirymidyny

• kwas moczowy

• spadek intensywności zabarwienia powodują:

• siarczan cynku, siarczan amonowy (0,1% i więcej)

• zobojętniony kwas trójchlorooctowy, nadchlorowy, aceton, mocznik (1% i więcej)

• etanol, eter (5% i więcej)

Bufory fosforanowe o stężeniu powyżej 0,1 M powodują zmętnienie prób.

BIAŁKO BENCE-JONES`A

Jest to białko termoprecypitacyjne, które spełnia następujące kryteria: przy ogrzewaniu do temperatury 56 ⁰C wytrąca się. Przy dalszym ogrzewaniu - rozpuszcza się. Przy oziębianiu w temperaturze 56 ⁰C ponownie się wytrąca i przy dalszym oziębianiu - ponownie się rozpuszcza. Jest ono wystarczająco małe, by swobodnie ulec filtracji.

Jego obecność w moczu może sugerować szpiczaka mnogiego - wtedy białko Bence-Jones`a odpowiada łańcuchom lekkim immunoglobulin. Stwierdza się je u 2/3 chorych.

Występuje również w makroglobulinemii Waldenströma.

GAMMAPATIE

GAMMAPATIA POLIKLONALNA

Jest spowodowana odpowiedzią na pojawienie się antygenu, który może być czynnikiem zewnętrznym lub wewnętrznym - czyli dochodzi do indukcji produkcji przeciwciał należących do różnych klas, stąd w elektroforegramie mamy płaski, szeroki pas γ-globulin.

Przyczyny:

• przewlekłe stany zapalne, infekcyjne i nieinfekcyjne, np. sarkoidoza, colitis ulcerosa

• choroby wątroby - marskość, przewlekłe agresywne zapalenie, będące zejściem ostrego zapalenia, w którym układ immunologiczny niszczy wątrobę

• kolagenozy - toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, ogniskowe zapalenie tętnic (SLE, RZS, PAN)

• choroby autoimmunologiczne - zapalenie tarczycy, cukrzyca typu 1

• nowotwory

GAMMAPATIA MONOKLONALNA

Jest spowodowana nadmierną produkcją przeciwciał przez dany klon komórek, zwykle w wyniku transformacji nowotworowej, co prowadzi do gromadzenia identycznych immunoglobulin. W elektroforegramie we frakcji γ-globulin jest jeden wąski, wysoki pik.

Przyczyny:

• szpiczak mnogi - 51%

• magroglobulinemia Waldenströma - 15%

• inne nowotwory złośliwe - 4%

• białaczki i chłoniaki - 2%

• marskość wątroby - 1,5%

• samoistna bezobjawowa (MGUS) - jest to tzw. stan przedszpiczakowy, często stwierdzany u ludzi starszych

• choroba Franklina

• szpiczak poronny tylko z lekkimi łańcuchami

Diagnostyka step-by-step:

1. Oznaczenie stężenia białka całkowitego - w 20% jest ono w normie.

2. Badanie elektroforetyczne białek z densytometrem.

3. Immunoelektroforeza.

4. Immunofiksacja (zamiast immunoelektroforezy).

5. Oznaczenie stężenia poszczególnych klas immunoglobulin - najczęściej stwierdza się wzrost stężenia IgG.

6. Metoda termoprecypitacyjna - oznaczanie białka Bence-Jones`a w moczu.

7. Wykrywanie łańcuchów lekkich metodą immunologiczną.

8. Rozmaz krwi obwodowej.

9. Punkcja szpiku z mostka lub talerza biodrowego.

10. Diagnostyka różnicowa dla wykluczenia innych przyczyn gammapatii. (Głównie w przypadku gammapatii poliklonalnej dla wykluczenia chorób wątroby.)

MIKROALBUMINURIA

Jest to wydalanie albumin z moczem przekraczające 30 mg/dobę (20 mg/l), przy braku jawnego białkomoczu.

Jest ona wczesnym wskaźnikiem rozwijającej się nefropatii cukrzycowej, jest także wykorzystywana do monitorowania nefropatii nadciśnieniowej i jako wskaźnik ogólnoustrojowego uszkodzenia śródbłonka naczyń - uogólnionego wzrostu przepuszczalności ściany naczyniowej dla makrocząsteczek.

Mechanizm mikroalbuminurii w nefropatii cukrzycowej opiera się na glikowaniu składników błony podstawnej kłębuszka, co prowadzi do destrukcji elektroujemnej bariery filtracyjnej zapobiegającej przesączaniu białek o ujemnym ładunku cząsteczki uszkodzenie tej bariery pozwala na filtrację ujemnie naładowanych białek, np. albumin, które do tej pory nie były przepuszczane.

GLUKOZURIA

glukozuria = cukromocz

W warunkach prawidłowych, glukoza jest całkowicie nieobecna w moczu (ewentualnie jej wydalone ilości są poniżej czułości pasków - 100 mg%).

Ulega ona filtracji kłębuszkowej, jednak jest całkowicie resorbowana w cewkach proksymalnych. Jest to jednak substancja progowa, co oznacza, że jeżeli zostanie przekroczone pewne jej stężenie w osoczu, cała glukoza nie będzie w stanie ulec resorpcji zwrotnej i co za tym idzie, pewna jej ilość dostanie się do moczu ostatecznego.

Glukoza jest wykrywana w moczu dzięki testom pasowym, opierającym się na reakcji enzymatycznej z oksydazą glukozową, w której glukoza utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. To powoduje zmianę barwy paska testowego, co porównuje się ze skalą barw na opakowaniu. Można również dokonać odczytu przy użyciu analizatora moczu.

Próg nerkowy dla glukozy: 160-180 mg%

Rozróżnia się trzy typy cukromoczu:

1. cukromocz łagodny:

• typ A -obniżenie progu nerkowego i obniżenie maksymalnej resorpcji glukozy

• typ B - obniżony próg nerkowy, resorpcja glukozy w normie

• typ C - zupełny brak resorpcji glukozy

2. cukromocz w przebiegu cukrzycy i cukrzycy ciężarnych

3. cukromocz w przebiegu dysfunkcji kanalików nerkowych - zespół Fanconiego

TEST KAY`A

Cel:

• ocena czynności wydzielniczej żołądka w warunkach podstawowych i w warunkach maksymalnego pobudzenia wydzielania żołądkowego

Oznaczane parametry:

• BAO - basic acid output - wydzielanie podstawowe, gdy żołądek nie jest pobudzony

• MAO - maximal acid output - maksymalne wydzielanie, po pobudzeniu żołądka; jest wprost proporcjonalne do ilości sprawnych funkcjonalnie komórek okładzinowych

• PAO - peak acid output - wydzielanie szczytowe

Wykonanie:

1. Odpowiednie przygotowanie pacjenta: 12h na czczo, przez 48h przed nie powinien przyjmować leków wpływających na czynność wydzielniczą żołądka, test wykonuje się rano.

2. Założenie sondy i odessanie treści żołądkowej - może być odrzucony lub wykorzystany do innych oznaczeń.

3. Przez godzinę, co 15 minut, odsysa się sok żołądkowy. Uzyskane 4 frakcje służą do określenia BAO.

4. Po godzinie podaje się środek pobudzający wydzielanie kwasu solnego (histaminę, pentagastrynę).

Histamina jest najtańsza, ale może wywołać niekorzystne efekty i ma szereg przeciwwskazań (astma oskrzelowa, nadciśnienie tętnicze, niewydolność krążenia, uczulenia). Przy stosowaniu histaminy należy pamiętać o podaniu preparatu antyhistaminowego (np. fenazoliny).

Pentagastryna jest małocząsteczkowym analogiem gastryny i jest lepiej tolerowana. Nie ma też przeciwwskazań do podawania. Niestety jest dość droga.

5. Przez kolejną godzinę, co 15 minut, zbiera się sok żołądkowy - uzyskane 4 frakcje posłużą do określenia MAO i wyliczenia PAO. Mierzy się objętość każdej frakcji i miareczkuje ją 0,1 molowym roztworem wodorotlenku sodowego wobec czerwieni fenolowej, która zmienia barwę w pH 7,4.

PAO wylicza się sumując 2 najwyższe sąsiadujące wartości frakcji MAO pomnożone przez 2. Wartości PAO są zbliżone do MAO.

Normy:

• BAO - do 5 mmol/h

• MAO - 5-25 mmol/h

Interpretacja:

• bardzo małe wartości MAO i BAO świadczą o zaniku błony śluzowe żołądka

• MAO powyżej 25 mmol/h spotyka się w chorobie wrzodowej dwunastnicy

Uwagi:

• test Kay`a nie ma żadnej przydatności diagnostycznej w przypadku choroby wrzodowej żołądka i nie może służyć do jej rozpoznawania

Test Kay`a znalazł zastosowanie przy diagnostyce guza wydzielającego gastrynę (gastrinoma), czyli w zespole Zollingera-Ellisona. Charakterystyczne dla tego zespołu są:

• wysokie wartości BAO

• stosunkowo niewielki wzrost po pobudzeniu (MAO)

Przy podejrzeniu tego zespołu pomocne jest obliczenie stosunku BAO/MAO, który prawidłowo nie przekracza 0,43. W rozwiniętym zespole Zollingera-Ellisona stosunek ten przekracza 0,6.

achylia gastrica - brak wydzielania kwasu solnego i enzymów żołądkowych

achlorhydria - bezkwaśność

hipochlorhydria - zmniejszone wydzielanie kwasu solnego (niskie MAO)

hipercholrhydria - zwiększone wydzielanie kwasu solnego (wysokie MAO)

METODY WYKRYWANIA HELICOBACTER PYLORI

Helicobacter pylori jest bakterią kolonizującą błonę śluzową żołądka człowieka. Wywiera ona szkodliwy wpływ na ochronną barierę śluzową i samą śluzówkę. Endotoksyny przez nią produkowane zaburzają wbudowywanie grup siarczanowych do glikoprotein śluzu. Jej obecność w żołądku zwiększa ryzyko rozwoju choroby wrzodowej dwunastnicy, żołądka, zapalenia błony śluzowej i niektórych nowotworów żołądka.

METODY INWAZYJNE

• test ureazowy

H. pylori posiada ureazę, enzym nieobecny w komórkach człowieka. Pobrany wycinek błony śluzowej żołądka umieszcza się na krążku bibuły i zwilża 2-3 kroplami wody destylowanej. Bibuła zawiera mocznik i wskaźnik barwny. Jeśli bakteria jest obecna, zachodzi reakcja:

(NH₂)₂CO + H₂O 2 NH₃ + CO₂

NH₃ + H₂O NH₄⁺ + OH^-

(powoduje to alkalizację środowiska i zmianę barwy wskaźnika)

• hodowla bakteriologiczna (metoda mikrobiologiczna)

• wykrywanie materiału genetycznego bakterii (PCR)

• badanie histopatologiczne (stwierdzenie obecności bakterii spiralnych)

METODY NIEINWAZYJNE

• test oddechowy

Pacjentowi podaje się drogą doustną mocznik znakowany izotopem. Jeśli w żołądku obecna jest bakteria, to następuje rozkład mocznika, a uwolniony CO₂ ze znakowanym atomem węgla zostaje wchłonięty. We krwi powstaje z niego HCO₃^-. Dostaje się do płuc, przechodzi w CO₂ i zostaje wytchnięty. Do jego wykrycia stosuje się licznik scyntylacyjny.

• metody immunologiczne

Testy te polegają na wykryciu obecności we krwi przeciwciał IgG skierowanych przeciwko antygenom
H. pylori. Test ten nie jest jednak dokładny, ponieważ przeciwciała utrzymują się we krwi od kilku miesięcy do nawet 2 lat po przebytym zakażeniu H. pylori. Testy te nie nadają się więc do oceny skuteczności leczenia zakażenia tą bakterią.

DIAGNOSTYKA ZABURZEŃ LIPIDOWYCH

1. Czy istnieje hiperlipidemia?

• należy wykonać podstawowe badania panelu lipidowego

Jaki to typ hiperlipidemii?

• podział wg EAS

• podział wg Fredricksona

3. Jakie są przyczyny?

• należy określić, czy przyczyna jest pierwotna, czy wtórna!

• drogą eliminacji należy wykluczyć przyczyny wtórne:

• wywiad

• badanie fizykalne

• TSH

• glukoza na czczo + OGTT

• enzymy wątrobowe (AlAT, AspAT, LDH)

• kreatynina, kwas moczowy, osad moczu

• aktywność α-amylazy we krwi i w moczu

• Jakie są czynniki ryzyka i ryzyko globalne?

• pozalipidowe czynniki ryzyka:

• wiek

• płeć

• palenie papierosów

• nadciśnienie

• cukrzyca

• choroba wieńcowa

• choroba wieńcowa u krewnych I stopnia

• nieprawidłowy WHR (Waist to Hip Ratio)

• Jaki wybrać typ prewencji?

• pierwotna

• wtórna - tej podlegają pacjenci z wystąpieniem zdiagnozowanej CHD lub ekwiwalentów

• Jaki jest cel terapii?

• zależy od typu prewencji

• LDL na poziomie:

• < 70 mg/dl - pacjenci o bardzo wysokim ryzyku (zdiagnozowana CHD i wiele czynników ryzyka, poważne i słabo kontrolowane czynniki ryzyka, np. palenie, zespół metaboliczny, przebycie ostrego incydentu wieńcowego)

• < 100 mg/dl - pacjenci z CHD lub jej ekwiwalentami

• < 130 mg/dl - 2 lub więcej czynnikami ryzyka, przy 10-letnim ryzyku wg Framingham poniżej 20%

• < 160 mg/dl - pacjenci o 0 lub 1 czynniku ryzyka

OBLICZANIE LDL








Wzór Friedewalda:

LDL (mmol/l) = TCh - HDL - (TG/2,2)

LDL (mg%) = TCh - HDL - (TG/5)

Ograniczenie:

• stężenie triglicerydów przekraczające 450 (lub 400) mg%.

Przeliczniki:

• triglicerydy: 100 mg% = 1,15 mmol/l

• cholesterol: 100 mg% = 2,58 mmol/l

OZNACZANIE MODYFIKACJI LIPOPROTEIN








1. Reakcja dialdehydu malonowego (MDA) z kwasem tiobarbiturowym. Powstaje barwny produkt pomiędzy kwasem tibarbiturowym a niektórymi produktami peroksydacji lipidów w środowisku kwaśnym w podwyższonej temperaturze. Tworzący się produkt jest różowy.

Norma u osób zdrowych:

mężczyźni 3,1 - 0,6 μmol/l

kobiety 3,0 - 0,5 μmol/l

2. Jodometryczny pomiar stężenia nadtlenków - jodek jest utleniany przez wodoronadtlenki. Badanie należy przeprowadzić w warunkach beztlenowych w atmosferze argonu lub azotu. Uwolniony jod jest mierzony absorpcjometrycznie.

3. Spektrofotometryczna detekcja koniugowanych dienów: oderwanie atomu wodoru od reszty wielonienasyconego kwasu tłuszczowego powoduje przegrupowanie wiązań, w wyniku czego powstają sprzężone dieny. Można zaobserwować charakterystyczny pik absorpcji światła przy długości fali 234 nm.

4. Chemiluminescencja - emisja światła podczas procesu peroksydacji lipidów może nastąpić, kiedy w wyniku reakcji zachodzącej pomiędzy 2 rodnikami nadtlenowymi tworzy się tlen singletowy lub w reakcji między 2 rodnikami alkoksylowymi prowadzącej do powstawania ketonów w stanie wzbudzonym.

ELISA








Jest to metoda heterogenna II generacji, stosowana w biochemii klinicznej do oznaczania stężeń:

• hormonów

• markerów nowotworowych

• immunoglobulin

• leków we krwi

Może też być wykorzystywana w serologii i w badaniach parazytologicznych, bakteriologicznych i wirusologicznych.

ELISA pozwala na ilościowe oznaczenie wyniku, jest stosunkowo tania, nie naraża personelu na promieniowanie jonizujące, a odczynniki są dość stabilne.

Znaczniki i substraty:

ENZYM	ŹRÓDŁO	SUBSTRAT
peroksydaza	chrzan	o-fenylodiamina (OPD) tetrametylenobenzydyna (TMB) kwas 5-aminosalicylowy (5-AS)
fosfataza alkaliczna	E. coli	p-nitrofenylofosforan
D-galaktozydaza	E-coli	nitrofenylo-D-galaktozyd

BIAŁKOMOCZ








BIAŁKOMOCZ - wydalanie białka z moczem w stężeniu powyżej 500 mg/dobę. Fizjologicznie dobowe wydalanie białka z moczem nie przekracza 150 mg.

Podział:

1. Wg przyczyny:

1. Kłębuszkowy - białkomocz spowodowany zwiększonym przesączaniem białek osocza w kłębuszkach spowodowany najczęściej uszkodzeniem błon granicznych.

• selektywny - przesączaniu ulegają tylko niektóre białka, jak np. w mikroalbuminurii

• nieselektywny - przesączane są i małe i duże białka; świadczy to o większym stopniu uszkodzenia bariery filtracyjnej

2. Kanalikowy - wywołany zmniejszonym wchłanianiem kanalikowym małocząsteczkowych białek osocza we wrodzonych lub nabytych zaburzeniach kanalikowych, najczęściej w ostrej niewydolności nerek.

3. Wydzielniczy - w wyniku wydzielania do moczu białek wytwarzanych w kanalikach nerkowych

2. Wg natężenia

1. Znikomy - do 500 mg/dobę.

2. Mierny - od 0,5 do 3,5 mg białka na dobę.

3. Znaczny - powyżej 3,5 mg na dobę.

Białko w moczu można oznaczyć metodami ilościowymi i jakościowymi:

• Metody ilościowe: metodą referencyjną jest zmodyfikowana metoda Extona polegająca na turbidymetrycznej ocenie zmętnienia powstałego w wyniku reakcji z kwasem sulfosalicylowym i siarczanem sodu. Poza tym stosuje się metodę biuretową.

• Metody jakościowe: obecność białka w próbce wykrywa się odczynnikiem MacWilliamsa lub metodą termicznej denaturacji białka.

UROBILINA








Urobilina jest obecna w moczu w wyniku utleniania się urobilinogenu pod wpływem powietrza. Urobilinogen powstaje w wyniku rozprzęgania bilirubiny przez bakterie w przewodzie pokaramowym, następnie kilkakrotnej redukcji, reabsorpcji do krążenia wrotnego i przejścia przez wątrobę do krążenia ogólnego.

Oznaczenie urobiliny przeprowadza się w moczu z odczynnikiem Ehrlicha czyli paradimetylobenzaldehydem. Jest to metoda półilościowa - możemy określić, czy urobilina jest wzmożona, silnie wzmożona, nieobecna lub obecna.

W warunkach prawidłowych, urobilinogen jest obecny, wszystkie pozostałe sytuacje są patologiczne.

DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA ŻÓŁTACZEK








BADANIE	TYP ŻÓŁTACZKI
		HEMOLITYCZNA	MIĄŻSZOWA	CHOLESTATYCZNA
bilirubina całkowita:	↑	↑	↑
bilirubina pośrednia:	↑	↑	bz
bilirubina bezpośrednia:	bz	↑	↑
bilirubina w moczu:	brak	obecna	obecna
urobilinogen w moczu:	↑	↑	bz/↑
sterkobilinogen w kale:	↑	↑	brak
żelazo w surowicy:	↑	↑	↓
odczyn van den Bergha:	pośredni	dwufazowy	bezpośredni
protrombina:	bz	↓	↓
enzymy indykatorowe:	bz	↑	bz/↑
enzymy cholestazy:	bz	bz/↑	↑
oporność krwinkowa:	↓	bz	bz
haptoglobina:	↓	bz/↓	bz
albumina:	bz	↓	bz/↓
Lp(X):	brak	brak	obecna

WOLNE RODNIKI








Do wolnych rodników zaliczamy:

• rodnik ponadtlenkowy - powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu molekularnego

• rodnik hydroksylowy - jest produktem spontanicznej lub enzymatycznej reakcji, katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową. Tworzy się on również w reakcji Fentona i Habera-Weissa

Podobne właściwości, chociaż nie posiadają niesparowanych elektronów, wykazują inne reaktywne formy tlenu - RFT:

• tlen singletowy - powstaje m. in. w wyniku działania peroksydaz, a także reakcji między innymi RFT

• nadtlenek wodoru- tworzony w czasie dwuelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego.




RFT w warunkach fizjologicznych biorą udział m. in. w:

• procesach redox w łańcuchu oddechowym

• odtwarzaniu wiązań bogatoenergetycznych

• odtruwaniu organizmu

• syntezie prostaglandyn i leukotrienów

• podziałach komórek i rozwoju organizmu

• metabolizmie ksenobiotyków

• agregacji płytek.

W patogenezie, wolne rodniki mają znaczenie w:

• karcinogenezie

• zespole reperfuzji

• toksycznym uszkodzeniu spowodowanym związkami chemicznymi takimi jak CCl₄, alkohol i dym papierosowy

Dzieje się tak dlatego, ponieważ RFT wpływają na:

• uszkodzenie struktury DNA

• pękanie chromosomów

• depolimeryzację kwasu hialuronowego

• tworzenie nieprawidłowych wiązań krzyżowych w kolagenie i elastynie

• uszkodzenie struktury i funkcji błon komórkowych

• inaktywację enzymów.

PEROKSYDACJA LIPIDÓW








Przebieg:

Proces peroksydacji składa się z 3 faz:

1. inicjacji, polegającej na oderwaniu atomu wodoru id cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub takiej reszty wchodzącej w skład fosfolipidu

2. prolongacji będącej tworzeniem rodników nadtlenkowych

3. terminacji, czyli powstawania dimerów kwasów tłuszczowych lub zmodyfikowanych cząsteczek lipidów.

Produkty peroksydacji - dimery kwasów tłuszczowych, keto- i hydroksykwasy tłuszczowe:

• zmieniają właściwości antygenowe białek

• hamują aktywność enzymów, co prowadzi do hamowania transkrypcji i replikacji DNA

• powodują pęknięcia nici DNA

• są cytotoksyczne

• działają mutagennie i karcinogennie

• obniżają hydrofobowość lipidowego wnętrza błon komórkowych

• wpływają na depolaryzację błony

• zaburzają asymetrię lipidową błon

• hamują aktywność enzymów błonowych i białek transportowych

• powodują rozprzęganie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach.

Peroksydacji mogą ulegać również inne związki - białka, aminokwasy i kwasy nukleinowe, jednak procesy te zachodzą z mniejszą wydajnością i mają mniejsze znaczenie dla organizmu.

METODA QUICKA








Cel:

• oznaczania czasu protrombinowego

Jest to czas krzepnięcia osocza szczawianowego (krew pobiera się na szczawian potasu) w obecności nadmiaru jonów wapnia i nadmiaru tromboplastyny (TF).

Jest to test pozwalający na ocenę aktywności osoczowych czynników krzepnięcia krwi II, V, VII i X ocena „drogi zewnątrzpochodnej”. Na podstawie wyniku tego testu można, prócz układu krzepnięcia, ocenić funkcje wątroby, ponieważ czynniki te, z wyjątkiem V, są produkowane przez wątrobę, a ponieważ czynnik VII jest białkiem o bardzo małym czasie półtrwania, patologiczny wynik PT otrzymamy bardzo szybko po uszkodzeniu wątroby ogromne znaczenie diagnostyczne.

Podwyższony PT spotyka się również w niedoborze witaminy K o różnej etiologii. Test ten jest stosowany jako kontrola leczenia przeciwzakrzepowego oraz w przypadku leczenia innych zaburzeń krzepnięcia krwi.

Norma:

12-18 sekund

INR - 0,8-1,4

wskaźnik Quicka - 80-120%

BIAŁKO THP








= BIAŁKO TAMMA-HORSFALLA

• pierwszy raz opisane przez Igora Tamma i Franka Lappina Horsfalla w 1950 roku

• przeważający składnik moczu fizjologicznego

• w środowisku zasadowym jego rozpuszczalność jest większa

Budowa:

• 616 aminokwasów

• masa cząsteczkowa ok. 68 kDa

• 20% aminokwasów, 30% węglowodanów

• zawiera grupy sialowe i siarkowe

Funkcje:

• udział w procesie zagęszczania moczu

• transport elektrolitów

• obrona nabłonka nerkowego przed infekcjami

• procesy autoimmunomodulacyjne

Rola w stanach patologicznych:

• tworzenie złogów śródmiąższowych

• tworzenie kamieni

• tworzenie wałeczków

Zastosowanie:

Oznaczanie dobowego wydalania THP stosuje się do monitorowania funkcjonalnego stanu nerek i szybkości regeneracji kanalików nerkowych po transplantacji nerek, a także do monitorowania stanu nerek w leczeniu nefrotoksycznym.

WAŁECZKOMOCZ








WAŁECZKI NERKOWE

• białkowe odlewykanalików nerkowych

• w moczu o odczynie kwaśnym

• walcowaty kształt, najwęższe powstają w cewkach bliższych

• powstają na skutek przechodzenia białka do światła kanalików na skutek zmian strukturalnych

WAŁECZKI SZKLISTE

• przeźroczyste

• bez widocznej struktury

• ich duża obecność może świadczyć o zespole nerczycowym

WAŁECZKI WOSKOWE

• powstają gdy strąt białkowy stanowiący ich budulec jest mętny

• mają wysoki współczynniki załamania światła

• faliste zarysy

• są dowodem na przewlekłe, zapalne choroby nerek

WAŁECZKI ZIARNISTE

• tworzą się przez precypitację białka gdy równocześnie w moczu obecne są rozpadłe leukocyty lub erytrocyty

• budowa regularna

• ostro zaznaczone zarysy

• struktura ziarnista

• występują w schorzeniach zapalnych

• są wyrazem zwyrodnienia komórek nabłonka nerkowego

WAŁECZKI NABŁONKOWE

• powstają w wyniku złuszczania się komórek nabłonkowych

• budowa regularna

• pojawiają się w zapaleniu kłębków nerkowych, nerczycy, stwardnieniu naczyń nerkowych

WAŁECZKI RZEKOME

• nie są prawdziwymi wałeczkami

• mogą powstać z bakterii, leukocytów, moczanów bezpostaciowych, śluzu

OSAD MOCZU








• krwinki czerwone - 1-3 wpw

• krwinki białe - 2-5 wpw

• komórki nabłonkowe

• wałeczki

• moczany bezpostaciowe - w moczu kwaśnym

• kwas moczowy

• szczawian wapniowy - w moczu kwaśnym, obojętnym i zasadowym, świadczy o kamicy

• kwas hipurowy - przy przyjmowaniu preparatów zawierających sól kwasu benzoesowego lub salicylowego

• cystyna

• leucyna i tyrozyna - w ostrym żółtym zaniku wątroby, marskości wątroby, białaczce, zatruciach fosforem

• fosforan amonowo-magnezowy

• fosforany bezpostaciowe - w przeroście gruczołu krokowego

• kryształy cholesterolu - bezbarwne schodkowane tabliczki

• kryształy bilirubiny - cienkie igły, w żółtaczkach

BILIRUBINA W MOCZU








Prawidłowo nie występuje.

Powstaje w wyniku katabolizmu rdzenia porfirynowego hemoglobiny i innych hemoprotein.

Jest wydalana po sprzęgnięciu z kwasem glukuronowym do żółci.

W moczu pojawia się, gdy utrudnione jest wydalanie glukuronianu bilirubiny z żółcią: żółtaczka mechaniczna i miąższowa, niedrożność dróg żółciowych.

METODA ROSINA

Utlenienie jodem bilirubiny do zielonej biliwerdyny.

METODA GMELINA

Stężony kwas azotowy utlenia obecne w moczu barwniki żółciowe do barwnych pochodnych na kolor fioletowy lub zielony.

ciolcik 2010

64

---