ENZYMOLOGIA
Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa
Centrum Bioimmobilizacji
i Innowacyjnych Materiałów
Opakowaniowych
ul. Klemensa Janickiego 35
Ćwiczenie 4
Inwertaza (II)
Kinetyka reakcji enzymatycznych
Ćwiczenie 4
Inwertaza (II). Kinetyka reakcji enzymatycznych
Inwertaza (sacharaza, ²-fruktofuranozydaza) - enzym należący do grupy hydrolaz, zostaÅ‚ po
raz pierwszy wyizolowany z ekstraktu drożdży przez Berthelota w 1860 roku. Hydrolizuje
wiÄ…zania glikozydowe utworzone z udziaÅ‚em grupy hydroksylowej w poÅ‚ożeniu ², zwiÄ…zanej
z węglem anomerycznym (C2) pierścienia fruktofuranozy. Sacharaza powoduje hydrolizę
dwucukru sacharozy do glukozy i fruktozy, trójcukru rafinozy do fruktozy i dwucukru
melibiozy. Głównym, naturalnym substratem ²-fruktofuranozydazy jest sacharoza (Rys.1).
Inwertazy występują w bakteriach i innych mikroorganizmach, w roślinach wyższych (w
ścianie komórkowej) i u zwierząt. Przez pszczoły sacharaza wykorzystywana jest do
hydrolizy sacharozy podczas produkcji miodu. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza,
występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie.
Bogatym z
ródłem inwertazy są drożdże. Inwertaza drożdżowa wykazuje optimum działania w
pH 4.0 5.5. Aktywność enzymatyczną inwertazy można oznaczyć różnymi metodami np.
metodÄ… kolorymetrycznÄ… lub polarymetrycznÄ….
Rys.1. Sacharoza (Ä…-D-glukopiranozylo-²-D-fruktofuranozyd) z zaznaczonym miejscem dziaÅ‚ania
inwertazy (Dubin i Turyna, 1999)
Sacharoza to disacharyd zbudowany z Ä…-D-glukozy i ²-D-fruktozy poÅ‚Ä…czonych wiÄ…zaniem
glikozydowym 1-2. W większych ilościach występuje w burakach cukrowych i trzcinie
cukrowej. Nie posiada właściwości redukujących.
Zastosowanie sacharazy w technologii żywności
Sacharaza otrzymywana jest głównie z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Enzym ten może
być stosowany w produkcji cukierniczej, do przygotowania syropów cukru inwertowanego
używanego do wyrobu sztucznego miodu, cukierków, marmolad, konfitur, likierów itp.
2
Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji
w zależności od różnych czynników (stężenia reagujących substancji, temperatury, obecności
aktywatorów i inhibitorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji
i matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji, a czasem jej trwania. Poznanie
tych zależności pozwala na określenie szybkości, z jaką będzie przebiegać reakcja
w dowolnie obranym czasie i dowolnym stężeniu substratu.
Szybkość reakcji enzymatycznej mierzona jest najczęściej przyrostem produktu lub ubytkiem
substratu w jednostce czasu.
Zasadniczym założeniem teorii Michaelisa-Menten, jako podstawy rozważań
kinetycznych, jest konieczność wytworzenia odwracalnego kompleksu między enzymem
i substratem (1)
(1)
S  substrat,
E  enzym,
[ES]  kompleks enzym  substrat,
P  produkt
k  stała szybkości reakcji
Kompleks ten podlega przemianie nieodwracalnej do produktu (lub produktów) P
z uwolnieniem enzymu. Dla pełnego scharakteryzowania kinetyki tych przemian niezbędne są
stałe szybkości reakcji. Ponieważ w porównaniu ze stężeniem substratu i produktu, stężenie
enzymu jest wielokrotnie mniejsze, więc w przybliżeniu można przyjąć, że stężenie
kompleksu ES jest stałe (szybkość jego powstawania jest zrównoważona szybkością
powstawania produktu) i zależy tylko od stężenia enzymu w roztworze. Oczywiście,
im większe jest stężenie kompleksu ES (a więc i enzymu), tym więcej produktu powstanie
w jednostce czasu.
Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji enzymatycznej w pewnych granicach
zależy od stężenia substratu (rys. 1). Jak wynika z przedstawionej krzywej, przy małym
stężeniu substratu w stosunku do stężenia enzymu zwiększenie szybkości reakcji wraz ze
zwiększeniem stężenia substratu jest do niego w przybliżeniu wprost proporcjonalne
(zależność liniowa) i odpowiada tzw. kinetyce pierwszego rzędu.
Natomiast przy dużym stężeniu substratu szybkość reakcji ma wartość maksymalną
Vmax i nie zależy od dalszego zwiększania jego stężenia. W tym przypadku reakcja podlega
kinetyce zerowego rzędu. Tego typu kinetykę obserwuje się przy osiągnięciu pełnego
wysycenia cząsteczek enzymu przez substrat. Wtedy dalsze zwiększanie stężenia substratu nie
może już powodować zwiększenia szybkości reakcji, gdy stężenie enzymu pozostaje stałe;
3
reakcja przebiega ze stałą szybkością. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu
przedstawiona na rys. 1 jest zgodna z następującym równaniem Michaelisa-Menten:
(2)
gdzie:
Vo  szybkość reakcji, Vmax  szybkość maksymalna, Km  stała Michaelisa, [S]  stężenie
substratu; graficznie równanie to przyjmuje postać hiperboli:
Rys. 1. Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji przy stałym stężeniu enzymu  krzywa
wg Michaelisa-Menten; Vmax-szybkość maksymalna, S-stężenie substratu, Km-stała
Michaelisa-Menten, a  reakcja pierwszego rzędu, b  reakcja o mieszanej kinetyce, c 
reakcja zerowego rzędu (Kączkowski 2005)
Jeżeli wartość [S] = Km, równanie (2) przybierze postać V = Vmax/2, czyli reakcja osiągnie
połowę szybkości maksymalnej. Takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji
stanowi połowę szybkości maksymalnej, nosi nazwę stałej Michaelisa (Km).
Odwrotność stałej (l/Km) jest nazywana powinowactwem enzymu do substratu. Z tej
zależności wynika, że mała wartość Km oznacza duże powinowactwo enzymu do danego
substratu i dużą szybkość procesu a duża wartość Km oznacza odwrotnie. Wartości stałej
Michaelisa, oznaczone dla wielu enzymów, wynoszÄ… przeważnie od 10-3 do 105¾ M.
Wartość Km można wyznaczyć graficznie z wykresu, jak podano na wykresie 1. Podana
metoda graficzna jest jednak niezbyt dokładna, nie daje bowiem pewności, czy została
osiągnięta szybkość maksymalna reakcji Vmax. O wiele dogodniejszym sposobem
4
wyznaczania wartości Km jest wykorzystanie równania Lineweavera  Burka, które jest
przekształceniem równania Michaelisa  Menten:
(3)
Przekształcenie to ma na celu uzyskanie równania linii prostej (y = ax + b). Wartości Km/Vmax
(a) i 1/Vmax (b) są wielkościami stałymi, stąd zależność 1/v od 1/[S] jest linią prostą. W
układzie współrzędnych wartości 1/v odkłada się na osi rzędnych a wartości 1/[S] na osi
odciętych. Wówczas równanie (3) daje linię prostą, której nachylenie określa stosunek
Km/Vmax (współczynnik regresji a) i która przecina oś rzędnych w punkcie wyznaczającym
1/Vmax (współczynnik regresji b), a oś odciętych w punkcie 1/Km (rys. 2). Na podstawie tego
wykresu można jednoznacznie wyznaczyć wartości stałej Km i Vmax.
Rys. 2. Graficzne przedstawienie równania Lineweavera  Burka; Vmax-szybkość
maksymalna, S-stężenie substratu, Km-stała Michaelisa-Menten (Kączkowski 2005)
Pomiary stałej Michaelisa dokonywane przy użyciu różnych substratów pozwalają
wnioskować o sposobie wiązania enzymu z substratem, a zastosowanie do badań
kinetycznych różnych aktywatorów i inhibitorów pozwala na wyciągnięcie wniosków
dotyczących budowy centrum katalitycznego enzymu oraz warunków powstawania
kompleksów enzym-substrat.
5
Część doświadczalna
Ćwiczenie 4
Inwertaza (II). Kinetyka reakcji enzymatycznych
Zasada: Inwertaza (sacharaza, ²-fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz rozszczepiajÄ…cych
wiÄ…zania ²-glikozydowe w sacharozie, hydrolizujÄ…c jÄ… do glukozy i fruktozy. Optymalne pH
działania enzymu wynosi ok. 4,7; przy pH 10 jest on już zupełnie nieaktywny.
Aktywność inwertazy można mierzyć metodą redukcyjną, ponieważ w miarę postępowania
hydrolizy sacharozy wzrasta stężenie cukrów redukujących. Do oznaczenia ilości cukrów
redukujących, w ćwiczeniu wykorzystano reakcję z kwasem pikrynowym, który przez cukry
redukowany jest do kwasu pikraminowego. Powstający w środowisku alkalicznym
pikraminian sodu daje czerwono-brązowe zabarwienie. W ćwiczeniu ilość cukrów
redukujÄ…cych oznaczono metodÄ… kolorymetrycznÄ… w przeliczeniu na mg glukozy uwolnione
z zastosowanego do analizy enzymatycznej substratu (sacharozy).
Metoda pozwala wyznaczyć szybkości początkowe reakcji przy różnych stężeniach sacharozy
i z wykresu Michaelisa-Menten lub Lineweavera  Burka wyznaczyć stałą Michaelisa.
I. Wykreślanie krzywej kalibracyjnej
1. Przygotować 6 probówek i oznaczyć je numerami od 0 do 5.
2. Do probówek odważyć odpowiednią ilość roztworu wzorcowego (0,25% roztwór
glukozy), a następnie uzupełnić wodą do 1 ml.
Zawartość probówek przygotować według schematu zamieszczonego w tabeli poniżej:
0
Nr probówki 1 2 3 4 5
(próbka zerowa)
0,25% wzorzec glukozy [g] 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Woda destylowana [g] 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Końcowa ilość glukozy [mg] 0 0,5 1 1,5 2 2,5
3. Do probówek dodać po 1,5 ml 10% NaOH oraz 1,5 ml 0,5% roztworu kwasu
pikrynowego, następnie zawartość probówek wymieszać i wstawić na 5 minut do wrzącej
Å‚az
ni wodnej.
4. Po wyjęciu probówek z wrzącej łaz
ni, wstawić je do łaz
ni lodowej również na 5 minut.
6
5. Po ochłodzeniu oznaczyć wartość absorbancji przy  = 530 nm wobec próbki zerowej
i wykreślić krzywą zależności wartości absorbancji (A) od ilości glukozy [mg].
Uwaga! Próbki zerowej proszę nie wylewać!
Krzywa wzorcowa (kalibracyjna) przedstawia zależność między absorbancją i stężeniem.
W tym przypadku roztwór stosuje się do prawa Lamberta-Beera, więc ma postać linii prostej
przechodzącej przez punkt przecięcia osi współrzędnych.
W celu przygotowania krzywej na podstawie wykonanych pomiarów absorbancji dla kilku
stężeń roztworu wzorcowego i wykreśla się krzywą odkładając na osi X mg glukozy, a na osi
Y odpowiednie wartości absorbancji. Należy tak dobierać podziałkę na osiach żeby krzywa
byÅ‚a nachylona do osi pod kÄ…tem mniej wiÄ™cej 45°. Ilość glukozy [mg] w próbie badanej
odczytuje siÄ™ ze sporzÄ…dzonej krzywej wzorcowej.
II. Wyznaczanie szybkości początkowych przy różnych stężeniach substratu
1. Przygotować dwa zestawy po 5 probówek. Pierwszy zestaw oznaczyć numerami t0, t5, t10,
t15, t20 (probówki w drugim zestawie ponumerować analogicznie dopisując symbol  czyli
t0 , t5 , itd.).
2. Do probówek t0, t0 , wprowadzić po 1,5 ml 10% NaOH.
3. Następnie przygotować 2 mieszaniny inkubacyjne o różnym stężeniu substratu według
schematu zamieszczonego w tabeli poniżej i natychmiast po wymieszaniu (t = 0) z każdej
probówki pobrać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej i dodać do probówek zawierających
1,5 ml 10% NaOH i włączyć minutnik na 5 minut.
Nr probówki 1 2
0,2 M roztwór sacharozy
6 3
w buforze octanowym
bufor octanowy [ml] 0 3
inwertaza [ml] 6 6
Końcowe stężenie
0,1 0,05
sacharozy [M]
4. W międzyczasie do pozostałych (przygotowanych w pkt. 1) probówek ponalewać
po 1,5 ml 10% NaOH i wprowadzać do nich pobrane po 5, 10, 15, 20 minutach próbki
inkubacyjne o obj. 1 ml. Uwaga! Próbki mieszaniny inkubacyjnej pobrane z probówki nr
1 dodawać kolejno do probówek t0, t5, t10 itd., natomiast próbki mieszaniny inkubacyjnej
pobrane z probówki nr 2 dodawać kolejno do probówek t0 , t5 , t10 itd.,
7
5. Po pobraniu ostatniej próbki do wszystkich 10 probówek dodać po 1,5 ml 0,5% roztworu
kwasu pikrynowego, następnie zawartość probówek wymieszać i wstawić na 5 minut do
wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej. Schemat doświadczenia przedstawiono w tabeli poniżej:
t0
Nr probówki
t5 t10 t15 t20
(próbka
kontrolna)
Czas inkubacji [min.] 0 5 10 15 20
NaOH [ml] 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Próbka mieszaniny
1 1 1 1 1
inkubacyjnej [ml]
0,5% roztwór kwasu
1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
pikrynowego [ml]
6. Po wyjęciu probówek z wrzącej łaz
ni, wstawić je do łaz
ni lodowej również na 5 minut.
7. Po ochłodzeniu oznaczyć wartość absorbancji przy  = 530 nm wobec próbki zerowej (tej
samej, której używano przy wyznaczaniu krzywej kalibracyjnej). Uwaga! Próbki zerowej
proszę nie wylewać!
8. Z krzywej kalibracyjnej odczytać ilości mg glukozy odpowiadającym poszczególnym
wartościom absorbancji uzyskanym dla próbek pobieranych po różnych czasach
z mieszanin o różnym stężeniu substratu.
9. Po odjęciu ilości mg glukozy przypadających na próbę kontrolną, wyniki przedstawić
w postaci wykresu zależności między ilością glukozy [mg], a czasem inkubacji (na osi
odciętych  czas w minutach, na osi rzędnych  ilość glukozy w mg). Wykresy
te należy sporządzić dla obydwu stężeń sacharozy (przykład na rys. 3).
Rys. 3. Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji przy różnych stężeniach substratu
(KÅ‚yszejko-Stefanowicz 2003)
10. Z wykresów należy wyznaczyć szybkości początkowe (vo) reakcji enzymatycznej (przykład
na rys. 3). W tym celu należy przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0. Styczna z
8
osią odciętych utworzy kąt ą, którego tangens jest miarą szybkości początkowej (vo).
Wartości tg ą nie wolno odczytywać z tablic na podstawie wartości kąta w stopniach,
ponieważ nanoszone na osi odciętych i rzędnych wartości nie są tej samej wielkości.
Oblicza się go ze stosunku wielkości przyprostokątnej przeciwległej do kąta ą, podanej w
wartościach odkładanych na osi rzędnych (mg glukozy), do przyprostokątnej przyległej do
kąta ą, podanej w wartościach odkładanych na osi odciętych (czas w minutach).
11. Z szybkości początkowych vo, wyliczonych dla obydwu stężeń substratu, wykreślić
zależność tych szybkości od stężenia substratu (krzywa Michaelisa-Menten) (rys. 4).
Ze względu na ograniczenia czasowe doświadczenie wykonywane jest jedynie dla dwóch
stężeń substratu, co sprawia, że wykreślona krzywa (hiperbola) ma przebieg jedynie
orientacyjny.
Rys. 4. Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten (Kłyszejko-
Stefanowicz 2003)
12. Wyznaczyć prostą dla równania Lineweavera  Burka  zależności 1/v od 1/[S] (Rys 5).
Wyznaczyć stałą Michaelisa Km oraz szybkość maksymalną Vmax.
9
Rys. 5. Graficzne przedstawienie równania Lineweavera  Burka (Kłyszejko-
Stefanowicz 2003)
Literatura:
1) Podstawy biochemii. KÄ…czkowski J. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa,
2005.
2) Praktikum z biochemii. Praca zbiorowa pod red. Dubina A. i Turyny B. Instytut Biologii
Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999.
3) Przepisy do ćwiczeń z biochemii. Praca zbiorowa pod red. Stryjeckiej-Zimmer M.
Akademia Medyczna im. prof. F. Skubiszewskiego w Lublinie, Lublin, 2004.
4) Ćwiczenia z biochemii. Praca zbiorowa pod red. Kłyszejko-Stefanowicz L. Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa, 2003.
5) Ogólna technologia żywności. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A.
Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2004.
10